Riboflavin İçeren Farmasötik Ko-Kristallerin Hazırlanması

3.2.5. Dokudan Riboflavin ve Riboflavin-5-Fosfat Sodyum Miktar Tayini İn vivo çalışmalarda kornea dokusundan riboflavin ve riboflavin-5-fosfat sodyum miktar tayini için LC-MS yöntemi kullanılmıştır ve kromatografik koşullar Tablo 3.3’de özetlenmiştir. Bu amaçla Q-TOF LC/MS (Agilent Technologies, ABD) cihazı kullanılmıştır.

Tablo 3.3. Riboflavin ve riboflavin-5-fosfat sodyum’un LC/MS ile miktar tayininde kullanılan kromatografik koşullar. (182)

Mobil Faz %0,1 Formik Asit / Asetonitril (Gradient) Kullanılan kolon ACE5 AQ 150x3.0mm

Akış hızı 0.6 mL.dk^-1

Dedektör Q-TOF

Nitrojen gazı akışı 14 L/dk

Kapiller Voltaj 1500 V pozitif, 1250 V negatif

Koni Voltajı 500 V

Kaynak sıcalığı 250°C

Desolvasyon sıcaklıığı 350°C Ekstraktör voltajı 400 V

İyon tarama aralığı m/z 100 - 500

3.3. Riboflavin veya Riboflavin-5-Fosfat Sodyum İçeren Formülasyonların

Ko-kristallerin hazırlanmasında yapılan ön denemeler sonunda, i) çözücü yardımı ile birlikte uçurma yöntemi (109) ve ii) birlikte karıştırma yöntemi (185) nin kullanılmasına karar verilmiştir.

Çözücü yardımı ile birlikte uçurma yöntemi

Bu yöntemde riboflavin ve ko-kristal yapıcı maddenin bir çözücüde çözüldükten sonra çözücünün uçurulması ile her iki maddenin birlikte çöktürülmesi gerçekleştirilmiştir (109). Yapılan ön denemeler sonucunda bu yöntemde çözücü olarak DMSO’nun kullanılmasına karar verilmiştir.

Bu yöntem için; 1 birim mol riboflavin ve 1 veya 2 birim mol nikotinamid, 1 birim mol riboflavin ve 1 veya 2 birim mol mannitol,

1 birim mol riboflavin ve 1 birim mol dekstroz, 1 birim mol riboflavin ve 1 birim mol trehaloz,

birlikte DMSO’da çözülmüş ve vakum altında 50°C’de ısıtma veya liyofilizatörde dondurarak kurutma yöntemi ile DMSO’nun uçması sağlanmıştır.

Birlikte karıştırma yöntemi

Bu yöntem için; 1 birim mol riboflavin ve 1 birim mol nikotinamid, 1 birim mol riboflavin ve 1 birim mol mannitol,

havanda veya bilyeli değirmende yardımcı çözücü kullanımı (etanol – metanol) da denenerek birlikte karıştırma işlemi yapılmıştır (185).

Ko-kristal hazırlanması için yapılan denemeler için detaylı bilgi Tablo 3.4.’de sunulmuştur. Daha sonra hazırlanan ko-kristal formülasyonlarının kontrolleri DSC, XRD ve FTIR analizleri ile yapılmıştır.

Tablo 3.4. Riboflavin’in Ko-Kristal Yapılarının Oluşturulması için Kullanılan Yöntemler. Formülasyon KoduEtken MaddeKo-Kristal MaddesiYöntemHazırlama Şekli 1R1T Liyo1 k Riboflavin1 k TrehalozÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 1 k trehaloz'un DMSO'da çözüldükten sonra 3 gün + 3 gün olacak şekilde liyofilize edilmesi. 1R1D Liyo1 k Riboflavin1 k DekstrozÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 1 k dekstroz'un DMSO'da çözüldükten sonra 3 gün + 3 gün olacak şekilde liyofilize edilmesi. 1R1N Fiziksel1 k Riboflavin1 k NikotinamidFiziksel K.1 k Riboflavin ile 1 k nikotinamid'in hiçbir işlem yapılmaksızın fiziksel olarak karışımı. 1R1N Liyo1 k Riboflavin1 k NikotinamidÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 1 k nikotinamid'in DMSO'da çözüldükten sonra 3 gün + 3 gün olacak şekilde liyofilize edilmesi. 1R1N Vakum1 k Riboflavin1 k NikotinamidÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 1 k nikotinamid'in DMSO'da çözüldükten sonra 3 gün boyunca vakum altında DMSO'nun uçurulması. 1R1N Su1 k Riboflavin1 k NikotinamidÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 1 k nikotinamid'in suda çözüldükten sonra rotavaporda uçurulması. 1R1N MeOH1 k Riboflavin1 k NikotinamidÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 1 k nikotinamid'in metanolde çözüldükten sonra çeker ocakta kendiliğinden uçurulması. 1R1N ACN1 k Riboflavin1 k NikotinamidÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 1 k nikotinamid'in asetonitrilde çözüldükten sonra çeker ocakta kendiliğinden uçurulması. 1R2N MeOH1 k Riboflavin2 k NikotinamidÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 2 k nikotinamid'in metanolde çözüldükten sonra çeker ocakta kendiliğinden uçurulması. 1R2N ACN1 k Riboflavin2 k NikotinamidÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 2 k nikotinamid'in asetonitrilde çözüldükten sonra çeker ocakta kendiliğinden uçurulması. 1R2N Fiziksel1 k Riboflavin2 k NikotinamidÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 2 k nikotinamid'in hiçbir işlem yapılmaksızın fiziksel olarak karışımı. 1R2N Liyo1 k Riboflavin2 k NikotinamidÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 2 k nikotinamid'in DMSO'da çözüldükten sonra 3 gün + 3 gün olacak şekilde liyofilize edilmesi. 1R2N Vakum1 k Riboflavin2 k NikotinamidÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 2 k nikotinamid'in DMSO'da çözüldükten sonra 3 gün boyunca vakum altında DMSO'nun uçurulması. 1R2N Su1 k Riboflavin2 k NikotinamidÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 2 k nikotinamid'in suda çözüldükten sonra rotavaporda uçurulması. 1R2N Su Filtre1 k Riboflavin2 k NikotinamidÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 2 k nikotinamid'in suda çözüldükten sonra bir miktar rotavaporda uçurulması, çöken maddenin filtrasyonla toplanarak kurutulm 1R1M Fiziksel1 k Riboflavin1 k MannitolFiziksel K.1 k Riboflavin ile 1 k Mannitolün hiçbir işlem yapılmaksızın fiziksel olarak karışımı 1R1M Liyo1 k Riboflavin1 k MannitolÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 1 k Mannitolün DMSO'da çözüldükten sonra 3 gün + 3 gün olacak şekilde liyofilize edilmesi 1R1M Vakum1 k Riboflavin1 k MannitolÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 1 k Mannitolün DMSO'da çözüldükten sonra 3 gün boyunca vakum altında DMSO'nun uçurulması 1R1M Su1 k Riboflavin1 k MannitolÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 1 k Mannitolün suda çözüldükten sonra rotavaporda uçurulması 1R1M Su Filtre1 k Riboflavin1 k MannitolÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 1 k Mannitolün suda çözüldükten sonra bir miktar rotavaporda uçurulması, çöken maddenin filtrasyonla toplanarak kurutulması. 1R2M Fiziksel1 k Riboflavin2 k MannitolFiziksel K.1 k Riboflavin ile 2 k Mannitolün hiçbir işlem yapılmaksızın fiziksel olarak karışımı. 1R2M Liyo1 k Riboflavin2 k MannitolÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 2 k Mannitolün DMSO'da çözüldükten sonra 3 gün + 3 gün olacak şekilde liyofilize edilmesi. 1R2M Vakum1 k Riboflavin2 k MannitolÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 2 k Mannitolün DMSO'da çözüldükten sonra 3 gün boyunca vakum altında DMSO'nun uçurulması. 1R2M Su1 k Riboflavin2 k MannitolÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 2 k Mannitolün Suda çözüldükten sonra rotavaporda uçurulması. 1R2M Su Filtre1 k Riboflavin2 k MannitolÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 2 k Mannitolün Suda çözüldükten sonra bir miktar rotavaporda uçurulması, çöken maddenin filtrasyonla toplanarak kurutulmas 1R1M ACN1 k Riboflavin1 k MannitolÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 1 k Mannitolün asetonitrilde çözüldükten sonra çeker ocakta kendiliğinden uçurulması. 1R2M ACN1 k Riboflavin2 k MannitolÇözelti Y.U.1 k Riboflavin ile 2 k Mannitolün asetonitrilde çözüldükten sonra çeker ocakta kendiliğinden uçurulması. 1R1N B.D.1 k Riboflavin1 k NikotinamidBirlikte K.Y.1 k Riboflavin ile 1 k nikotinamid'in bilyalı değirmen ile bir saat karıştırılması. 1R1N B.D. MeOH1 k Riboflavin1 k NikotinamidBirlikte K.Y.1 k Riboflavin ile 1 k nikotinamid'in metanol yardımıyla bilyalı değirmen ile bir saat karıştırılması. 1R1N H.1 k Riboflavin1 k NikotinamidBirlikte K.Y.1 k Riboflavin ile 1 k nikotinamid'in havan ile yarım saat karıştırılması. 1R1N H. Etanol1 k Riboflavin1 k NikotinamidBirlikte K.Y.1 k Riboflavin ile 1 k nikotinamid'in etanol yardımıyla havan ile yarım saat karıştırılması. k: Birim mol, Çözelti Y.U.: Çözelti yardımıyla uçurma yöntemi, Birlikte K.Y.: Birlikte karıştırma yöntemi, Fiziksel K.: Fiziksel karışım

İn Vitro Lipofilisite Değerlendirme Çalışması

Hazırlanan ko-kristal formülasyonlarının in vitro lipofilisitelerinin tespit edilmesi için oktanol:su karışımındaki dağılım yüzdeleri hesaplanmıştır (186). Bunun için, hazırlanan ko-kristal formülasyonları 5 mg/100 mL olacak şekilde PBS içerisinde çözülmüştür. Bu çözeltilerden 5’er mL alınarak üstüne 5 mL 1-oktanol eklenmiş ve 30 dk yatay çalkalayıcıda ve sonra 1 saat boyunca ultrasonik banyoda karıştırılmıştır.

Örnekler 1 gece dinlendirildikten sonra PBS bölümü alınarak ve mobil fazla 10 kat seyreltilerek HPLC’de analiz edilmiştir.

3.3.2. Riboflavin veya Riboflavin-5-Fosfat Sodyum İçeren Hidrofilik Jel