3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.3.1. Kullanılan Malzemeler 1. Triptik soy besiyeri
2. Mikroplak (96 çukurlu ve düz tabanlı)
3. McFarland 0,5 standardına göre ayarlanmış A. baumannii izolatları 4. Steril fosfat çözeltisi (PBS) (400 ml)
5. Filtreden geçirilmiş kristal viyole (%1’lik) 6. Etanol (%95)
3.3.2. Yöntemin Uygulanması
Her izolat için test 3 kez tekrarlandı.
1. 180L triptik soy buyyon (TSB) düz tabanlı mikroplaklardaki her bir kuyucuğa dağıtıldı.
2. Negatif kontrol kuyucuklarına 200L TSB eklendi.
3. Test kuyucuklarının üzerine 20L 0,5 McFarland standardına göre ayarlanmış bakteri süspansiyonu eklendi.
4. 200L içeriğe sahip kuyucuklar, 35C’de 18-20 saat inkübe edildi.
5. İnkübasyon süresinin sonunda, çukurlar üç kez steril PBS ile yıkandı ve plaklar ters çevrilerek kuruması için beklendi.
6. Kuyucuklara 200L metanol eklendi ve 15-20 dk beklendi.
7. Süre sonunda metanol uzaklaştırıldı ve plaklar oda sıcaklığında kurumaya bırakıldı.
8. Kuyucuklar 20L %1’lik kristal viyole boyası ile boyandı ve 15 dk bekletildi.
9. Süre sonunda kuyucuklar otomatik pipetle karıştırıldı, musluk suyuyla yıkandı ve kuruması için yaklaşık 15 dk bekletildi.
10. Süre sonunda her bir çukura 100L %95’lik etanol eklendi.
11. Plakların üzeri kapatılarak oda sıcaklığında 10-15 dk bekletildi.
12. Süre sonunda çukurlar pipetle karıştırıldı.
3.3.3. Biyofilmin Ölçülmesi
Biyofilm oluşumu, Hacettepe üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı’nda bulunan spektrofotometre cihazında 620 nm’de ölçüldü.
3.4. Virülans Genlerinin Belirlenmesi 3.4.1. DNA İzolasyonu
DNA izolasyonu Mohajeri ve arkadaşları (206) tarafından önerilen yöntem ile gerçekleştirildi. Yöntemin uygulama basamakları aşağıda verilmiştir.
1. Kanlı agara tek koloni ekim yöntemi ile ekilen bakterilerin 18-24 saatlik inkübasyonu sonunda, bakteri kültüründen tek koloni alındı ve MHB’a ekildi. Besiyeri 37 °C’de 18 saat inkübe edildi.
2. İnkübasyonun ardından süspansiyon, 15 dakika 3000 xg’de santrifüj edildi.
Üstte kalan sıvı döküldü. Kalan kısım üzerine 1ml Tris/EDTA (TE) çözeltisi eklenerek vortekslendi ve mikrosantrifüj tüplerine aktarıldı.
3. Süspansiyon tekrar 1 dakika 8.000 xg’de santrifüj edildi ve üstteki sıvı atıldı.
4. Çökelti üzerine 1 ml TE tamponu eklenerek birkaç kez pipetaj işlemi uygulandı. Tüpler vortekslendi ve mikrosantrifüjde 1 dakika santrifüj edildi.
5. Üstte kalan sıvı alındıktan sonra yıkama işlemi (4. Basamak) en az 3 kez tekrarlandı. En son yıkamadan sonra üstteki sıvı atıldı, çökeltiye 100 µl TE tamponu eklendi ve tüpler ısı bloğuna konarak 15 dakika 100 °C’da bekletildi.
6. Bu işlemi takiben bakteriler mikrosantrifüjde 12,000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi. Üst sıvı, çökeltiye dokunmadan yeni bir steril mikrosantrifüj tüpüne alındı ve elde edilen DNA ileri moleküler testlerin uygulanması aşamasına kadar -20
°C’de saklandı.
3.4.2. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
Toplam dört farklı virülans geni PCR yöntemi ile araştırıldı.
blaOmp-A Protokolü Kullanılan Primerler
Kullanılan primerler 100 pmol/µlolacak şekilde sulandırıldı. Primer dizileri aşağıda verilmiştir.
blaOmp-A: F-5’-CAATTGTTATCTCTGGAC-3’ [966 baz çifti (bp)](55) blaOmp-A: R-5’-ACCTTGAGTAGACAAACGA-3’
PCR Karışımı
omp-A geninin amplifikasyonu için PCR karışımı Tablo 3.1.’de verilmiştir.
Tablo 3.1. omp-A geninin amplifikasyonu için PCR karışımı içeriği.
25 µl Son konsantrasyon
Su 13.7µl
Taq DNA tampon (10x) 2.5 µl 1x
MgCl2 (25mM) 2.5 µl 2.5 mM
dNTP (10 mM) 0.5 µl 200 µM
PrimerF (100 pmol) 0.3µl 30 pmol
PrimerR (100 pmol) 0.3µl 30 pmol
Taq polimeraz (5 U/µl) 0.2µl 1 U
DNA 5.0µl
PCR Koşulları
DNA amplifikasyonu ısı döngücihazı (Global Genomics Partner, MyGenie96, ABD) ile gerçekleştirildi. Amplifikasyon programı;
İlk denatürasyon 10 dakika 94°C’de gerçekleştirildikten sonra;
Denatürasyon 30 saniye 94°C Primer birleşmesi 30 saniye 52°C Amplifikasyon 1 dakika 72°C
olacak şekilde toplam 35 döngü olarak programlandı. Amplifikasyonun sonunda 72°C’de 10 dakika son uzamanın ardından reaksiyon sonlandırıldı.
blacsuE Protokolü Kullanılan Primerler
Kullanılan primerler 100 pmol/µl olacak şekilde sulandırıldı. Primer dizileri aşağıda verilmiştir.
csuE: F-5’-ATGCATGTTCTCTGGACTGATGTTGAC-3’ (976 bp) (207) csuE: R-5’-CGACTTGTACCGTGACCGTATCTTGATAAG-3’
PCR Karışımı
csuE geninin amplifikasyonu için PCR karışımı Tablo 3.2.’de verilmiştir.
Tablo 3.2. csuE geninin amplifikasyonu için PCR karışımı.
25 µl Son konsantrasyon
Su 16.7µl
Taq DNA tampon (10x) 2.5 µl 1x
MgCl2 (25mM) 2.5 µl 2.5 mM
dNTP (10 mM) 0.5 µl 200 µM
PrimerF (100 pmol) 0.3µl 30 pmol
PrimerR (100 pmol) 0.3µl 30 pmol
Taq polimeraz (5 U/µl) 0.2µl 1 U
DNA 2.0µl
PCR Koşulları
DNA amplifikasyonu ısı döngü cihazı (Global Genomics Partner, MyGenie96) ile gerçekleştirildi. Amplifikasyon programı;
İlk denatürasyon 10 dakika 94°C’de gerçekleştirildikten sonra;
Denatürasyon 30 saniye 95°C Primer birleşmesi 30 saniye 63°C Amplifikasyon 1 dakika 72°C
olacak şekilde toplam 35 döngü olarak programlandı. Amplifikasyon 72°C’de 10 dakika son uzama ile reaksiyon sonlandırıldı.
blacsgAM PCR Protokolü Kullanılan Primerler
Kullanılan primerler 100 pmol/µl olacak şekilde sulandırıldı. Primer dizileri aşağıda verilmiştir.
csgAM: F-5’-ACTCTGACTTGACTATTACC-3’ (200 bp) (208) csgAM: R-5’-AGATGCAGTCTGGTCAAC-3’
PCR Karışımı
csgAM geninin amplifikasyonu için PCR karışımı Tablo 3.3.’te verilmiştir.
Tablo 3.3. csgAM geninin amplifikasyonu için PCR karışımı.
25 µl Son konsantrasyon
Su 13.7µl
Taq DNA tampon (10x) 2.5 µl 1x
MgCl2 (25mM) 2.5 µl 2.5 mM
dNTP (10 mM) 0.5 µl 200 µM
PrimerF (100 pmol) 0.3µl 30 pmol
PrimerR (100 pmol) 0.3µl 30 pmol
Taq polimeraz (5 U/µl) 0.2µl 1 U
DNA 5.0µl
PCR Koşulları
İlk denatürasyon 1 dakika 95°Cgerçekleştirildikten sonra;
Denatürasyon 30 saniye 95°C Primer birleşmesi 30 saniye 48°C Amplifikasyon 1 dakika 72°C
olacak şekilde toplam 30 döngü olarak programlandı. Amplifikasyon sonunda 5 dakika 72°C’de son uzamanın ardından reaksiyon sonlandırıldı.
blaFimH PCR Protokolü Kullanılan Primerler
Kullanılan primerler 100 pmol/µl olacak şekilde sulandırıldı. Primer dizileri aşağıda verilmiştir.
fimH: F-5’-TGCAGAACGGATAAGCCGTGG-3’ (508 bp) (209) fimH: R-5’-GCAGTCACCTGCCCTCCGGTA-3’
PCR Karışımı:
fimH geninin amplifikasyonu için PCR karışımı Tablo3.4’te verilmiştir.
Tablo 3.4. fimH geninin amplifikasyonu için PCR karışımı.
25 µl Son konsantrasyon
Su 13.7µl
Taq DNA tampon (10x) 2.5 µl 1x
MgCl2 (25mM) 2.5 µl 2.5 mM
dNTP (10 mM) 0.5 µl 200 µM
PrimerF (100 pmol) 0.3µl 30 pmol
PrimerR (100 pmol) 0.3µl 30 pmol
Taq polimeraz (5 U/µl) 0.2µl 1 U
DNA 5.0µl
PCR Koşulları
İlk denatürasyon 5 dakika 94°C’de gerçekleştirildikten sonra;
Denatürasyon 45 saniye 94°C Primer birleşmesi 30 saniye 58°C Amplifikasyon 45 saniye 72°C
olacak şekilde toplam 35 döngü olarak programlandı. Amplifikasyon sonunda 5 dakika 72°C’de son uzamanın ardından reaksiyon sonlandırıldı.
PCR yönteminin uygulanması sırasında A. baumannii ATCC 19606 suşu pozitif kontrol olarak kullanıldı.
3.4.3. Agaroz Jel Elektroforezi
Steril olarak hazırlanan 50X TAE (242g TRİS, 57,1 ml glasiyel asetik asit, 0,5 M EDTA, pH 8) çözeltisinden 20 ml alınarak 1lt distile suya tamamlandı ve 1XTAE çözeltisi hazırlandı.
Agaroz, 250ml 1XTAE içerisinde %2’lik olacak şekilde tartıldı. Tamponun içerisinde eritilen agaroz daha sonra 45-50°C’ye soğutuldu ve içerisine 15µl etidyum bromür çözeltisi eklendi. Düz bir zeminde agaroz jelin döküleceği kalıp hazırlandı ve agaroz elektroforez tankına dökülerek katılaşması beklendi. Önceden hazırlanan 1X TAE çözeltisiagaroz jel elektroforez tankının içerisine yerleştirilen jelin üzerine üstünü kapatacak şekilde döküldü.
PCR ürünlerinin herbirinden 10µl alınıp 5µl Orange G yükleme tampon (Sigma-Aldrich, Almanya) ile karıştırıldı ve jeldeki kuyucuklara yüklendi. Moleküler ağırlık standardı olarak 100 bp belirteç (New England Biolabs Inc., Ipswhich, MA, ABD) kullanıldı. Yürütme işlemi 110 voltta 120 dakikada gerçekleştirildi. Yürütülen jel, distile su içinde çalkalanarak fazla boyanın uzaklaştırılması sağlandı ve jel görüntüleme sistemi Jel BioSpectrum 500 (UVP, Cambridge, Birleşik Krallık) ile ultraviyole ışık altında incelendi. PCR ürünlerinde blafimH, blaompA, blacsuE, blacsgAM
genlerinin varlığı araştırıldı.
4. BULGULAR 4.1. Biyofilm Yapımının Değerlendirilmesi
Negatif kontrole göre yapılan değerlendirmede, izolatların 94’ünde (%60,25) biyofilm yapımı gösterilmiştir. Her test grubundaki negatif kontrol optik dansite (OD) değeri izolataait OD değerinden çıkarılıp, her izolat için ortalama değer bulunmuştur.
Negatif kontrol değerinin ortalaması bulundu ve bu değerin 2x ve 4x değerleri hesaplanmıştır. Buna göre yapılan değerlendirme şöyledir:
Zayıf pozitif: ODc˂izolat sonucu OD˂2xODc
Orta pozitif: 2xODc˂izolat sonucu OD˂4xODc
Kuvvetli pozitif: İzolat sonucu OD˃4xODc
Bu değerlendirmeye göre, 94 izolatın negatif kontrol eşik değeri üzerindeki biyofilm yapım düzeylerine göre 17’sinin zayıf pozitif, 33’ünün orta pozitif ve 44’ünün güçlü pozitif olduğu tespit edilmiştir.
A.baumannii izolatlarının elde edildiği merkezlere göre değerlendirmesi yapıldığında, biyofilm yapan izolatların %22,34 (21/94)’ünün tek bir merkezden olduğu belirlenmiştir. Bu merkezden olan izolatların 11’inin daha önceki bir çalışmada belirlenmiş olan PFGE grupları arasından PFGE grup II’de yer aldığı saptanmıştır.
Biyofilm yapan izolatların en fazla PFGE gruplarından grup II (17/94) ve grup VI (14/94)’da yer aldığı tespit edilmiştir. Çalışılan izolatların elde edildiği merkezlere göre biyofilm yapımı açısından dağılımı Tablo 4.1’de gösterilmiştir.
Tablo 4.1. İzolatların elde edildiği merkezlere göre biyofilm yapımı.
G, güçlü biyofilm yapımı; O, orta biyofilm yapımı, Z, zayıf biyofilm yapımı T; toplam biyofilm yapımı; EH, Eğitim Hastanesi
Biyofilm Yapımı Negatif Toplam Yüzde
G O Z T %
Hacettepe 0 2 3 5 2 7 71,42
Ankara EH 0 3 3 6 6 12 50
Ege 0 1 0 1 3 4 25
Lütfi Kırdar 15 3 5 23 7 30 76,66
Ankara AEH 1 5 1 7 12 19 36,84
Erzurum 6 5 2 13 5 18 72,22
Gazi 3 5 8 37,5
Çanakkale 0 0 0 0 10 10 0
Kayseri EAH 6 4 1 11 11 22 50
Mersin 16 7 2 25 1 26 96,15
Toplam 44 33 17 94 62 156 60,25
Yapılan test işlemleri sırasında elde edilen negatif/pozitif kontrollerin ve izolatların üç kere okuma yapılan optik dansite ortalamalarına göre, ortalama biyofilm biyokütle oluşturma kapasitesinin 2,2371±0,0033 olduğu belirlenmiştir (Şekil 4.2).
Şekil 4.1. OD550’de biyofilm biyokütle dağılımı (2,237±0,0033)
4.2. Virülans Genlerinin Değerlendirilmesi 4.2.1. ompA Geninin Değerlendirilmesi
Test edilen izolatların %21,79’u (34/156) ompA geni açısından pozitif bulunmuştur. İzolatların elde edildiği merkezlere göre ompA geni açısından değerlendirilmesi Tablo 4.2’de verilmiştir.
Tablo 4.2. Elde edildiği merkezlere göre izolatların ompA geni varlığı açısından değerlendirilmesi.
Şekil 4.2. ompA Geninin Agaroz Jel Görüntüsü. M; moleküler belirteç, P; pozitif örnek, N; negatif örnek.
ompA Sayı Pozitif Negatif %
Hacettepe 7 1 6 14,28
Ankara EAH 12 3 9 16,66
Ege 4 3 1 25
Lütfi Kırdar 30 13 17 36,66
Ankara AEH 19 2 17 0
Erzurum 18 5 13 11,11
Gazi 8 0 8 0
Çanakkale 10 0 10 0
Kayseri EAH 22 3 19 9,09
Mersin 26 4 22 15,38
Toplam 156 34 122 21,79
4.2.2. csuE Geninin Değerlendirilmesi
Test edilen izolatların %32,05’i (50/156) csuE geni açısından pozitif bulunmuştur. İzolatların elde edildiği merkezlere göre csuE geni varlığı açısından değerlendirilmesi Tablo 4.3’te verilmiştir.
Tablo 4.3. csuE geninin PCR analizi sonuçları ve merkez bazında sıklığı.
Şekil 4.3. csuE Geninin Agaroz Jel Görüntüsü. M; moleküler belirteç, P; pozitif örnek, N; negatif örnek.
csuE Sayı Pozitif Negatif %
Hacettepe 7 2 5 28,57
Ankara EAH 12 3 9 25
Ege 4 0 4 0
Lütfi Kırdar 30 26 4 86,66
Ankara AEH 19 5 14 26,31
Erzurum 18 1 17 5,55
Gazi 8 0 8 0
Çanakkale 10 0 10 0
Kayseri EAH 22 0 22 0
Mersin 26 3 23 11,53
Toplam 156 40 116 25,64
4.2.3. csgA Geninin Değerlendirilmesi: Test edilen izolatların %71,15’i (111/156) csgA geni açısından pozitif bulunmuştur. İzolatların elde edildiği merkezlere göre csgA geni açısından değerlendirilmesi Tablo 4.4’de verilmiştir.
Tablo 4.4. Elde edildiği merkezlere göre izolatların csgAgeni varlığı açısından değerlendirilmesi.
Şekil 4.4. csgA Geninin Agaroz Jel Görüntüsü. M; moleküler belirteç, P; pozitif örnek, N; negatif örnek.
csgA Sayı Pozitif Negatif %
Hacettepe 7 7 0 100
Ankara EAH 12 12 0 100
Ege 4 4 0 100
LK 30 24 6 80
Ankara AEH 19 15 4 78,94
Erzurum 18 13 5 72,22
Gazi 8 0 8 0
Çanakkale 10 7 3 70
Kayseri EAH 22 11 11 50
Mersin 26 17 9 65,38
Toplam 156 110 46 71,15
4.2.4. fimH Geninin Değerlendirilmesi
Test edilen izolatların %7,05’i (11/156) fimH geni açısından pozitif bulunmuştur.
İzolatların elde edildiği merkezlere göre fimH geni varlığı açısından değerlendirilmesi Tablo 4.5’de verilmiştir.
Tablo 4.5. fimH geninin PCR analizi sonuçları ve merkez bazında sıklığı.
fimH Sayı Pozitif Negatif %
Hacettepe 7 0 7 0
Ankara EAH 12 0 12 0
Ege 4 0 4 0
Lütfi Kırdar 30 0 30 0
Ankara AEH 19 2 17 10,52
Erzurum 18 9 9 50
Gazi 8 0 8 0
Çanakkale 10 0 10 0
Kayseri EAH 22 0 22 0
Mersin 26 0 26 0
Toplam 156 11 145 7,05
Şekil 4.5. fimH Geninin Agaroz Jel Görüntüsü. M; moleküler belirteç, P; pozitif örnek, N; negatif örnek.
4.2.5. Biyofilm Oluşturan İzolatlar ile Virülans Geni Varlığının Karşılaştırılması
Tüm izolatlarda csgA, csuE, ompA ve fimH virülans genlerinin sıklığı sırasıyla,
%70,51 (s=110), %25,64 (s=40), %21,79 (s=34), %7,05 (s=11) şeklinde saptanmıştır.
Bunlar arasında csgA, csuE, ompA ve fimH virülans geni pozitif olduğu halde biyofilm oluşturmayan izolatlar sırasıyla %64,54 (s=71), %52,5 (s=21), %32,35 (s=11) ve
%54,54 (s=6) olarak belirlenmiştir.
Biyofilm varlığı saptanan 94 izolatın 79’unda (%84.0) virülans geni varlığı saptanmıştır. Biyofilm yapan izolatlarda csgA, csuE, ompA ve fimH virülans genlerinin sıklığı sırasıyla, %41,48 (s=39), %20,2 (s=19), %24,46 (s=23) ve %5,31 (s=5) olarak tespit edilmiştir. A. baumannii izolatlarındaki virülans genleri ile biyofilm yapım düzeyi arasındaki ilişki Tablo 4.6’da gösterilmiştir.
Güçlü biyofilm oluşturan izolatlar arasında 12 izolat iki, bir izolat üç virülans geni pozitif bulunmuştur. Orta düzey biyofilm oluşturan izolatlarda yedi izolat iki, bir izolat üç virülans geni pozitif olarak belirlenmiştir. Zayıf biyofilm oluşturan izolatlarda ise iki izolat üç, bir izolat iki virülans geni pozitif saptanmıştır.
Tablo 4.6. A. baumannii izolatlarındaki virülans genleri ile biyofilm yapım düzeyi arasındaki ilişki.
Biyofilm yapımı csg (%) s
ompA (%) s
csuE (%) s
fimH (%) s
Güçlü 16 8 14 3
Orta 15 5 4 2
Zayıf 8 10 1 0
Toplam 39 (41,48) 23 (24,46) 19 (20,2) 5 (5.31)
5. TARTIŞMA
A. baumannii, hastane enfeksiyonları açısından yatan hastaları kolonize etme ve enfeksiyon oluşturma bakımından en dikkat çekenpatojendir. Sıklıkla yoğun bakım ünitelerinde ventilatör ilişkili pnömoni enfeksiyonuna neden olmasına rağmen, bakteriyemi, üriner sistem enfeksiyonu ve sekonder menenjit gibi hastane kökenli enfeksiyonlarda da önemli bir patojendir (206). Çok sayıda antibiyotiğe karşı gelişen direnç nedeniyle Acinetobacter enfeksiyonları tedavi edilmesi oldukça güç enfeksiyonlar arasında yer almaktadır. A. baumannii izolatları cansız yüzeylerdeki kuruluğa karşı oldukça dirençlidir. Rodriguez ve arkadaşları (55), özellikle şant ilişkili bakteriyemi ve kateter ilişkili idrar yolu enfeksiyonlarında tanımlanan A.baumannii izolatlarının cansız yüzeylerde sıklıkla biyofilm oluşturma yeteneğinde olduğunu göstermişlerdir. Biyofilm, bakterilerin kendi ürettikleri hücre dışı matrikse veya ekzopolisakkarite gömüldükleri ve bu matriks içinde birbiriyle iletişim halinde olan bir grup mikroorganizma topluluğudur (50, 51). Biyofilm oluşturma kabiliyetinin kazanılması, örneğin konağın istilası sırasında veya antibiyotik tedavisi sonrasında bakterinin karşılaştığı streskoşullarında, mikroorganizmanın hayatta kalmasını artırmak için iyi bir stratejidir. Biyofilm içinde üreyen bakteri hücrelerinin insan bağışıklık sisteminin bileşenlerine ve çeşitli antimikrobiyal ilaçlara karşı oldukça dirençli olduğu görülmektedir. Biyofilm yapan bakteride ekzopolisakkarit sentezi ile birlikte antibiyotiklere direnç gelişimi izlenmektedir. Artan ekzopolisakkarit başta antimikrobiyal ilaçların olumsuz etkisi olmak üzere bakteriyi birçok olumsuz ortam şartlarından koruyucu özellik göstermektedir (210). Buna ek olarak, bakteri hücrelerinin direnç genlerini aktarma yeteneği, biyofilm toplulukları içinde artmakta ve böylece antibiyotik direncinin yayılmasını kolaylaşmaktadır (17). Buna bağlı olarak, biyofilm oluşturabilen A. baumannii türleri, antibiyotik etkisi altında seçilmekte veyaA. baumanniiartan mutasyon oranı ile biyofilm içinde çok ilaca karşı direnç kazanabilmektedir. Her iki durumda da, A. baumannii'nin yüksek kolonize olma kapasitesi, birden fazla ilaca karşı direnç gösterme yeteneği ile birleşince, organizmanın hayatta kalmasına ve hastane ortamında daha fazla yayılarak salgınların ortaya çıkmasına neden olmaktadır.
A. baumannii klinik izolatlarının cam yüzeylere yapışma ve biyofilm oluşturma
kabiliyetini gösteren çalışmalar bulunmaktadır (211,212). A.baumannii’nin yüzeylere yapışma ve biyofilm oluşturma yeteneği, hem konak-patojen ilişkisi hem de tıbbi aletler ile ilişkili enfeksiyonlar açısından önemli role sahiptir. Vidal ve arkadaşları (210) solunum yolu enfeksiyonundan sorumlu A. baumannii izolatının lamel yüzeyinde biyofilm oluşturduğunu ve bunun ekzopolisakkarite benzeyen amorf bir maddeden oluştuğunu bulmuşlardır. Son zamanlarda, etanolün abiyotik yüzeylerde biyofilm oluşumunu etkilediği de bildirilmiştir.
Siroy ve arkadaşları (211), çok ilaca dirençli klinik izolatların anlamlı oranda biyofilm oluşturduğunu ve bu biyofilm oluşturma yeteneğinin, epitel hücre aderansı ile anlamlı bir korelasyon gösterdiğini belirtmiştir.
Çalışmamızda, 156 izolattan 94’ünde (%60,25) biyofilm üretimi saptanmıştır.
Rodriguez ve arkadaşları (55), klonal ilişkisi olmayan 92 izolatın 56’sında (%63) biyofilm yapımı olduğunu tespit etmiştir. Rajamohan ve arkadaşları (212), kan, yara ve idrar yolu enfeksiyonlarından elde edilen 83 izolatın 35’inde (%42) biyofilm varlığını göstermişlerdir. Duarte ve arkadaşları (213), tamamı çok ilaca dirençli olan örneklemde, biyofilm oluşturma oranını %74,7 olarak bulmuştur. Tüm bu çalışmalarla karşılaştırıldığında, araştırmamızda elde ettiğimiz %60,25 oranındaki biyofilm yapımıbenzerlik göstermektedir. King ve arkadaşları (40), çok ilaca dirençli A.baumannii izolatlarını duyarlı izolatlarla karşılaştırdıklarında, cansız yüzeylerde biyofilm oluşturma yeteneğinin daha düşük olduğunu belirtmişlerdir.
Çalışmamızda farklı bir bakış açısıyla çok ilaca dirençli oldukları kanıtlanmış ve farklı merkezlerden elde edilen, PFGE ile kökenleri doğrulanmış hastane enfeksiyonu etkeni olan invaziv A. baumannii izolatlarında biyofilm varlığı araştırılmıştır.
Çalışmamıza dahil edilen izolatların ait olduğu hasta grubunda üriner-santral kateterizasyon ve mekanik ventilasyon oranları yüksektir. Bu nedenle, çalışmamızda saptananizolatların yüksek biyofilm oluşturma potansiyelinin, yabancı cisim ilişkili (Foley kateter, venöz kateter ve serebrospinal şant) çok ilaca dirençli A. baumannii’ye
bağlı hastane enfeksiyonlarının patogenezinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir.
Çalışmamızda mikroplak yöntemi sonucuabsorbans ölçülerek tespit edilen biyofilm varlığı, %60,25 (94/156) oranında izolatların yarısından fazlasında tespit edilmiştir. Pozitif kontrolün ve izolatların üç kere okuma yapılan optik dansite ortalamalarına göre, ortalama biyofilm biyokütle oluşturma kapasitesinin 2,2371±0,0033 olduğu belirlenmiş ve standart izolata göre yapılan kıyaslamada invaziv izolatların standarta göre daha yüksek seviyede biyofilm oluşturdukları kanıtlanmıştır.
Biyofilm oluşumunun çok faktörlü doğasına göre, bir dizi gen ürününün canlı ve cansız yüzeylerde A.baumannii'nin aderansında ve biyofilm gelişiminde rol oynadığı bildirilmiştir. csuA/BABCDE şaperon bağımlı pili oluşum sisteminin bir parçası olan csuE gen ekspresyonuna bağlı olarak abiyotik yüzeylerde A.baumannii ATCC 19606 suşunda pili oluşumunu takiben biyofilm oluştuğu ve bahsi geçen csuA/BABCDE operonunun klinik izolatlarda yaygın olduğu gösterilmiştir (214,215).
Tomaras ve arkadaşları (216), A.baumannii ATCC 19606'nın plastik ve cam yüzeylere yapıştığını ve biyofilm oluşturduğunu,csuC ve csuE çerçeve kayması mutasyonları sonucunda pilisiz hücrelere neden olduğunu, yapışma ve biyofilm oluşumunun ortadan kaldırıldığını ortaya koymuştur. Öte yandan, kısa süre önce, açil homoserin lakton (AHL) sentezinin A. baumannii ATCC 17978 suşunun, biyofilm içindeki hücrelerinde serbest haldeki hücrelere oranla daha fazla olduğu tanımlanmıştır.
(217). Bu durum, bakterilerin biyofilm içinde çevreleriyle ve birbirleriyle iletişimi nasıl sağladıklarını ve ortam koşullarına göre gen ekspresyonunu nasıl düzenlediklerini izah etmektedir.
Çalışmalar, 38 kDa ağırlığında üç üniteli bir porin olan OmpA dış membran proteinin, A.baumannii’nin plastik yüzeylere tutunmasında ve bunun yanısıra insan epitel hücrelerine ve Candida albicans filamanlarına tutunmasında anahtar rol oynadığını göstermiştir (43, 47). OmpA proteini, bakteri hücresinin konak hücreye yapışmasındaki rolü dışında, epitel hücresi ölümü, erken başlangıçlı apoptoz,
dendritik hücrelerde nekrozu geciktirme, mitokondriayı hedef alarak reaktif oksijen türlerinin üretimini indükleme gibi birçok işlevi nedeniyle potansiyel bir virülans faktörüdür (217,218).
FimH, tip 1 fimbriyal adezin proteinidir ancak fimbriya oluşumu için mutlaka gerekli değildir. csgA ise, fimbrianın yapısal alt birimi olan ‘major curlin subunit’ikodlayan gendir. Momtaz ve arkadaşları (219) tarafından 2015 yılında yapılan bir çalışmada, fimH geninin sıklığı %74 olarak verilirken, Mohajeri ve arkadaşları (206) tarafından yapılan çalışmada fimH geninin sıklığı %60 ve csgA geninin sıklığı ise %54 olarak saptanmıştır. Çalışmamızda, fimH geninin sıklığı %7,05 ve csgA geninin sıklığı ise %71,15 olarak belirlenmiştir.
Sonuç olarak bu çalışma, çok ilaca dirençli invaziv A. baumannii izolatlarında biyofilm oluşumunun yüksek oranda olduğunu göstermiştir. Çalışmaya dahil edilen izolatlar arasında (n=156) csgA, csuE, fimH ve ompAgenleri sırasıyla %71,15, %32,05,
%7,05, %22,0’sinde saptanmıştır. Biyofilm yapımı gösteren izolatlar arasında csgA, csuE, ompA ve fimH virülans genlerinin sıklığı ise sırasıyla, %41,48, %20,2, %24,46 ve
%5,31 olarak tespit edilmiştir. Bu çalışmada çok ilaca dirençli invaziv A. baumannii izolatlarında biyofilm yapımı gösteren izolatlarda virülans gen varlığının saptanması, bu izolatlarda virülans ile biyofilm yapımının ilişkili olabileceğini ancak bunların biyofilm yapımı için gerekli olmadığını göstermiştir. Virülans genlerinin biyofilm yapımıyla ilişkisinin kanıtlanabilmesi için daha ayrıntılı çalışmalara gereksinim bulunmaktadır.
6. SONUÇ ve ÖNERİLER
Bu tez çalışması, çok ilaca dirençli ve invaziv A. baumannii izolatlarının virülans genlerini ve kantitatif biyofilm varlığını göstermeyi ve antibiyotik direnci ile biyofilm yapımı arasında ilişki olup olmadığını saptamayı amaçlayan bir araştırmadır.
Hacettepe Üniversitesi Hastaneleri dahil olmak üzere Türkiye’deki 10 merkezden toplanan çok ilaca dirençliinvaziv A.baumannii izolatlarının biyofilm yapımı ve virülans faktörleri açısından değerlendirilmesi Türkiye sonuçlarını tespit etme açısından önemlidir. Bu çalışma, çok ilaca dirençli invaziv A. baumannii izolatlarında biyofilm oluşumu ile çok ilaca direnç arasında güçlü bir ilişki olduğunu göstermiştir.
Bu çalışmada çok ilaca dirençli invaziv A. baumannii izolatlarında biyofilm yapımı gösteren izolatlarda virülans gen varlığının saptanması, bu izolatlarda virülans ile biyofilm yapımının ilişkili olabileceğini ancak özelliklefimH geninin biyofilm yapımı için gerekli olmadığını göstermiştir. Virülans genlerinin biyofilm yapımıyla ilişkisinin kanıtlanabilmesi için daha ayrıntılı çalışmalara gereksinim bulunmaktadır. Çok ilaca dirençli invaziv A. baumannii izolatları ile enfekte hastalar virülans genleri ve klonal yayılım da dikkate alınarak değerlendirilmelidir.
KAYNAKLAR
1. Henriksen SD. Moraxella, Acinetobacter and the mimeae. Bacteriol Rev. 1973;
37(4):522-61.
2. Peleg AY, Seifert H, Peterson DL. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev. 2008; 21(3):538-82.
3. Nemec A, Krizova L, Maixnerova M, Reijden TJ, Deschaght P, Passet V, et al.
Genotypic and phenotypic characterization of the Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex with the proposal of calcoaceticus-Acinetobacter pittii sp. nov.
(formerly Acinetobacter genomic species 3) and Acinetobacter nosocomialis sp. nov.
(formerly Acinetobacter genomic species 13TU). Res Microbiol. 2011; 162(4):393-404.
4. Dijkshoorn L, Nemec A, Seifert H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nat Rev Microbiol. 2007; 5(12):939-51.
5. Giamarellou H, Antoniadou A, Kanellakopoulou K. Acinetobacter baumannii:
A universal threat to public health. Int J Antimicrob Agents. 2008; 32(2):106-19.
6. Bardbari AM, Arabestani MR, Karami M, Keramat F, Alikhani MY, Bagheri KP.
Correlation between ability of biofilm formation with their responsible genes and MDR patterns in clinical and environmental Acinetobacter baumannii isolates.
Microb Pathog. 2017; (108):122-8.
7. Brossard KA., Campagnari AA. The Acinetobacter baumannii biofilm-associated protein plays a role in adherence to human epithelial cells. Infect Immun.
2012; 80(1):228-33.
8. Seifert H, Baginski R, Schulze A, Pulverer G. The distribution of Acinetobacter species in clinical culture materials. ZentralblBakteriol.1993; 279(4):544–52.
9. Seifert H, Strate A, Schulze A, Pulverer G. Bacteremia due to Acinetobacter species other than Acinetobacter baumannii. Infection. 1994; 22(6):379–85.
10. Seifert H, Dijkshoorn L, Gerner-Smidt P, Pelzer N, Tjernberg I, Vaneechoutte M. Distribution of Acinetobacter species on human skin: comparison of phenotypic and genotypic identification methods. J ClinMicrobiol.1997; 35(11):2819–25.
11. Dijkshoorn L, Aken E, Shunburne L, van der Reijden TJ, Bernards AT, Nemec A, et al. Prevalence of Acinetobacter baumannii and other Acinetobacter spp. in faecal samples from non-hospitalised individuals. Clin Microbiol Infect. 2005; 11(4):329-32.
12. Berlau J, Aucken H, Malnick H, Pitt T. Distribution of Acinetobacter species on skin of healthy humans. Eur J Clin Microbiol InfectDis. 1999; 18(3):179–183.
13. Metan G, Sariguzel F, Sumerkan B. Factors influencing survival in patients with multi-drug-resistant Acinetobacter bacteraemia. Eur J Intern Med. 2009; 20(5):540-4.
14. Zarrilli R, Giannouli M, Tomasone F, Triassi M, Tsakris A. Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii: the molecular epidemic features of an emerging problem in health care facilities. J Infect Dev Ctries. 2009; 3(5):335-41.
15. Falagas ME, Kopterides P. Risk factors for the isolation of multi-drugresistant Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa: a systematic review of the literature. J Hosp Infect. 2006; 64(1):7-15.
16. Lee YT, Fung CP, Wang FD, Chen CP, Chen TL, Cho WL. Outbreak of imipenem resident Acinetobacter calcoaceticus- Acinetobacter baumannii complex harboring different carbapenemase gene-associated genetic structures in an intensive care unit. J Microbiol ImmunolInfect. 2012;45(1):43-51.
17. Bergogne-Berezin E, Towner KJ. Acinetobacter spp. as nosocomial pathogens: microbiological, clinical, and epidemiological features. Clin Microbiol Rev. 1996;9(2):148–65.
18. Joly-Guillou ML. Clinical impact and pathogenicity of Acinetobacter. Clin Microbiol Infect. 2005;11(11):868-73.
19. Hujer KM, Hujer AM, Hulten EA, Bajaksouzian S, Adams JM, Donskey CJ, et al.
Analysis of antibioticresistance genes in multidrug-resistant Acinetobactersp. isolates from military and civilian patients treated at the Walter Reed Army Medical Center.
Antimicrob Agents Chemother.2006;50(12):4114–23.
20. Adams-Haduch JM, Paterson DL, Sidjabat HE, Pasculle AW, Potoski BA, Muto CA, et al. Genetic basis of multidrug resistance in Acinetobacter baumannii clinical isolates at a tertiary medical center in Pennsylvania. Antimicrob Agent Chemother.
2008; 52(11):3837–43.
21. Santolaya ME, Alvarez AM, Becker A. Prospective, multicenter evaluation of risk factors associated with invasive bacterial infection in children with cancer, neutropenia, and fever. J Clin Oncol. 2001; 19(14):3415-21.
22. Meckler G, Lindemulder S. Fever and neutropenia in pediatric patients with cancer. Emerg Med Clin North Am. 2009; 27(3):525-44.
23. Klastersky JA, Paesmans M. Treatment of febrile neutropenia is expensive:
prevention is the answer. Oncologie. 2011; 34(5):226-8.
24. Falagas ME, Karveli EA, Kelesidis I, Kelesidis T. Community-acquired Acinetobacter infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2007; 26(12):857-68.
25. Hawkey PM. The origins and molecular basis of antibiotic resistance. BritishMed J. 1998; 317(7159):657-60.
26. Costa GFM, Tognim MCB, Cardoso CL, CarraraMarrone FE, Marrone C, Garcia LB. Preliminary evaluation of adherence on abiotic and cellular surfaces of Acinetobacterbaumannii strains isolated from catheter tips. Braz J Infect Dis. 2006;
10:346-51.
27. Doughari HJ, Ndakidemi PA, Human IS, Benade S. The Ecology, biology and pathogenesis of Acinetobacter spp. Microbes Environ. 2011;26(2):101-12.
28. Aşık G. Acinetobacter baumannii virülansının açıklanmasında güncel yaklaşımlar. Mikrobiyol Bul.2011;45(2):371-80.
29. Lee JC, Koerten H, van den Broek P, Beekhuizen H, Wolterbeek R, van den Barselaar M, et al. Adherence of Acinetobacter baumannii strains to human bronchial epithelial cells. Res Microbiol. 2006;157(4):360-6.
30. Phuong K, Kakii K, Nikata T. Intergeneric coaggregation of non-flocculating Acinetobacter spp. isolates with other sludge constituting bacteria. J Biosci Bioeng.
2009;107(4):394-400.
31. Kaplan N, Rosenberg E, Jann B, Jann K. Structural studies of the capsular polysaccharide of Acinetobacter calcoaceticus BD4. Eur J Biochem. 1985; 152(2):453-8.
32. Rathinavelu S, Zavros Y, Merchant JL. Acinetobacter Iwoffii infection and gastritis. Microbes Infect. 2003; 5(7):651-7.
33. Towner K. The genus Acinetobacter. Prokaryotes. 2006;6(3):746-758.
34. Heidelberger M, Das A, Juni E. Immunochemistry of the capsular polysaccharide of an Acinetobacter. Pub Nat Acad Sci. 1969; 63(1):47-50.
35. Hostacka A, Klokocnikova L. Characteristics of clinical Acinetobacter spp.
Strains. Folia Microbiol. 2002;47(5):579-82.
36. Grotiuz G, Sirok A, Gadea P, Varela G, Schelotto F. Shiga toxin 2-producing Acinetobacter haemolyticus associated with a case of bloody diarrhea. J Clin Microbiol. 2006; 44(10):3838-41.
37. Doughari JH, Ndakidemi PA, Human IS, Bennade S. Shiga toxins (Verocytotoxins). Afr J Microbiol Res. 2009;3(11):681-93.
38. Lambert T, Gerbaud DM, Galimand M, Caurvalin P. Characterization of Acinetobacter haemolyticus aac(6’)-Ig gene encoding an aminoglycoside 6-N-acetyltransferase which modifies amikacin. Antimicrob Agents Chemother. 1993;
37(10):2093-3000.
39. Yu HB, Zhang YL, Lau YL, Yao F, Vilches S, Merino S, Tomas JM, et al.
Identification and characterization of putative virulence genes and gene clusters in Aeromonas hydrophila PPD134/91. Appl Environ Microbiol. 2005; 71(8):4469-77.
40. King LB, Swiatlo E, Swiatlo A, McDaniel LS. Serum resistance and biofilm formation in clinical isolates of Acinetobacter baumannii. FEMS Immunol Med Microbiol. 2009;55(3):414-21.
41. Mihara K, Tanabe T, Yamakawa Y, Funahashi T, Nakao H, Narimatsu S, et al.
Identification and transcriptional organization of a gene cluster involved in biosynthesis and transport of acinetobactin, a siderophore produced by Acinetobacter baumannii ATCC 19606T. Microbiol. 2004; 150(8):2587-97.
42. Vila J, Ribera A, Marco F, Ruiz J, Mensa J, Chaves J, et al. Activity of clinafloxacin, compared with six other quinolones, against Acinetobacter baumanni clinical isolates. J Antimicrob Chemother. 2002; 49(3):471-7.
43. Choi CH, Lee EY, Lee YC, Park TI, Kim HJ, Hyun SH, et al. Outer membrane protein 38 of Acinetobacter baumannii localizes to the mitochondria and induces apoptosis of epithelial cells. Cell Microbiol. 2005; 7(8):1127-38.
44. Costerton JW, Geesey GG, Cheng KJ. How bacteria stick. Sci Am 1978;
238(1):86-95.
45. Marshall KC, Stout R, Mitchell R. Mechanisms of the initial events in the sorption of marine bacteria to surfaces. J Gen Microbiol. 1971; 68:337-48.
46. Costerton JW, Lewandowski Z, Caldwell DE, Korber DR, et al. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 1995; 49:711-45.
47. Gaddy JA, Actis L. Regulation of Acinetobacter baumannii biofilm formation.
Future Microbiol. 2009; 4(3):273-8.
48. Brackman G, Coenye T. Quorum sensing inhibitors as anti-biofilm agents. Curr Pharm Des. 2015; 21:5-11.
49. Frolund B, Palmgren R, Keiding K, Nielsen PH. Extraction of extracellular polymers from activated sludge using a cation exchange resin. Water Res. 1996;30:
1749-58.