• Sonuç bulunamadı

2.4. Genetik Yapı ve Genetik Mühendisliğinde Kullanılan Teknikler ile İlgili Genel

2.4.6. Moleküler Biyoloji, Biyoteknoloji ve Genetik Mühendisliği Teknikleri

2.4.6.2. PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu)

Önceden klonlanmış genlerin korunan (yani benzer genlerde değişiklik göstermeyen) bölgelerinden geliştirilen PCR primerleri kullanımıyla aynı organizmadaki benzer genler veya aynı genin farklı organizmalardaki homologları klonlanabilir. Bu amaçla yine genin kodlayan dizisinin değişiklik göstermeyen bölgelerinden primerler geliştirilir. Kodon farklılıklarını engellemek için de mümkün olduğunca az sayıda kodon ile kodlanan amino asitlerin karşılık geldiği nükleik asit bölgesinden primer geliştirilmelidir. Primerler birkaç baz bakımından çok ihtimalli olabilirler ancak bu sayının mümkün olduğunca az olması gerekmektedir. PCR işlemi genomik DNA veya bir RNA preparatı üzerinde yapılabilir.

PCR tekniği ile çeltik bitkisinde kırmızı/kırmızı ötesi ışık reseptörü fitokrom sistemindeki yeni bir gen bilinen diğer genlerden hareketle izole edilmiştir. İki fitokrom genin PhyA ve PhyB’nin değişiklik göstermeyen Asp-Ile-Pro-Gln-Ala ve Ala-Cys-Glu-Phe- Leu amino asit dizilerine karşılık gelen nükleik asit dizisinden geliştirilen ve bazı bölgelerinde çoklu bazlara sahip olan primerler ile genomik DNA üzerinde PCR yapılmıştır.

Üretilen DNA’nın prob olarak kullanılması ile bir cDNA kütüphanesi araştırılarak PhyC geni klonlanmıştır.

PCR tekniği ile aynı genin farklı bitkilerdeki homologlarının klonlanmasına örnek olarak patateste bir etilen reseptör geni (Etr1) klonlanması verilebilir. İlk olarak Arabidopsis’te klonlanan Etr1 geninin homologları daha sonra diğer bitkilerde de elde edilmiştir. Etr1 homologları arasında korunmuş olan bölgelerden geliştirilen

primerler ile patates bitkisinden elde edilen RNA preparatı üzerinde RT-PCR yoluyla Etr1’in patatesteki homoloğu klonlanmıştır (Özcan, 2001).

(http://fmel.ifas.ufl.edu/fmbuzz/pcr.jpg)

organizmalar elde etmek üzere gen aktarımı için kullanılmasıdır.

Hücrelerde DNA doğal olarak replikasyon ile çoğalır. DNA çift sarmalında birbirinden ayrılan ipliklerin tamamlayıcısı sentezlenerek bir DNA molekülünden onunla aynı olan iki yavru molekül meydana gelir. Buna göre de hücre bölünmesiyle yeni oluşan hücrelere tüm genler aynen geçerler. Her yeni hücre jenerasyonunda genlerin kopya sayılarının iki katına çıkması nedeniyle jenerasyonlar boyunca RNA miktarı başlangıca göre üssel olarak artar. Örneğin otuz jenerasyon sonra hücre ve gen sayısında milyarlarca kez artış olur. İn vitro koşullarda istenilen genin ya da özgün bir DNA dizisinin çok sayıda kopyasının elde edilmesi için rekombinant DNA yöntemleri ile DNA klonlanmasına ek olarak, 1980’li yıllardan itibaren “Polimeraz Zincir Reaksiyonu” da kullanılmaya başlanmıştır.

PCR ile istenilen genlerin ya da DNA dizilerinin jenerasyonlara bağlı replikasyonu, hızlandırılmış bir şekilde gerçekleştirilir. Aynen doğal hücre bölünmesinde olduğu gibi, PCR replikasyon sürecini taklit ederek yaklaşık otuz jenerasyon sonra seçilmiş bir DNA dizisinin aşağı yukarı milyar katını kopyalar.

Polimeraz zincir reaksiyonu, spesifik bir DNA parçasının kopyalarının primerler tarafından yönlendirilerek, enzimatik olarak sentezlenmesi şeklinde tanımlanan in vitro bir yöntemdir. 1980’li yılların ortalarında Cetus firması araştırıcıları tarafından geliştirilmesinin ardından temel moleküler biyolojik araştırmalarda (klonlama, dizi analizi ve DNA haritalaması gibi) ve birçok hastalığın (orak hücre anemisi, kistik fibrozis, ‘‘Fragile X” sendromu, AIDS, lösemi vb.) DNA temeline dayalı tanısı için de klinik tıpta hızla kullanılmaya başlanmıştır. PCR ile insan genomik DNA’sı gibi kompleks DNA kalıplarından spesifik DNA parçalarının sentezinin birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir hale gelmesi, bu teknolojinin yaygınlaşmasında başlıca neden olmuştur.

Ayrıca günümüzde polimeraz zincir reaksiyonunu, allellik dizi varyanslarının gösterilebilmesi ile doku transplantasyonu için doku tipinin belirlenmesi, adli tıp örneklerinin genetik tiplendirilmesi (analık-babalık tayini) gibi tıbbın diğer kollarında, tarımda (tohum saflığının belirlenmesi), sistematık ve evolüsyon çalışmaları gibi birçok alanda (doğadaki çeşitli canlı türlerinin tanısı, türler arasındaki polimorfizmin belirlenmesi) kullanmak olası hale gelmiştir.

2.4.6.2.1.Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Oluşum Mekanizması

Polimeraz zincir reaksiyonu çift iplikli bir DNA molekülünde hedef dizilere iki oligonükleotid primerin bağlanması ve uzaması esasına dayanır. Ampilimer olarak da adlandırılan oligonükleotid primerler, kalıp DNA molekülü yüksek sıcaklık derecelerinde denatüre edildikten sonra, tek iplikli DNA molekülü üzerinde kendilerine tamamlayıcı olan bölgelerle melezlenir. Primerlerin spesifik olarak hedef dizilere bağlanması düşük sıcaklık derecelerinde gerçekleşir. DNA polimeraz enzimi, uygun tampon ve dört çeşit deoksiribonükleozid trifosfat (dNTP) varlığında primerin 3’ hidroksil ucundan uzamasını sağlar. Böylece DNA ipliğine tamamlayıcı olan yeni DNA molekülü sentezlenmiş olur. Bir PCR döngüsü denatürasyon, primerin bağlanması (“annealing”) ve uzama (“extension”) olarak adlandırılan üç aşamadan oluşur. Ardı ardına tekrarlanan denatürasyon, primerlerin bağlanması ve primerlerin uzaması evreleriyle DNA parçaları üssel olarak artar. Bu üssel artışın nedeni, bir döngü sonucu sentezlenen ürünün ardışık döngüde diğer primerler için kalıp görevi yapmasıdır. Böylece her PCR döngüsü DNA molekülü üzerinde istenilen bölgenin iki katına çıkmasıyla sonuçlanır. PCR boyunca biriken ürünlerin boyu iki primerin boyu ve hedef DNA bölgeleri arasındaki mesafelerin toplamı kadardır.

Matematiksel olarak amplifikasyon (2n-2n) X formülü ile ifade edilir. n=döngü sayısı

2n=birinci ve ikinci döngü sonucunda oluşan boyları bilinmeyen ürünler. X=orijinal kalıbın kopya sayısı

Potansiyel olarak her döngünün %100 verimle gerçekleştiği varsayılırsa örneğin 20 döngü sonucunda 220 kat ürün meydana gelir.

PCR verimini etkileyen önemli bir faktör, DNA polimeraz enzimidir. Normalde enzim miktarı, 25-30 PCR döngüsü sonucunda hedef dizi artışı ve termal denatürasyon nedeni ile sınırlayıcı bir etken haline gelir. Verimliliği azaltan diğer faktörde konsantrasyonu artan hedef dizilerin primer ile bağlanma yarışıdır (Temizkan, 2004).

Benzer Belgeler