Este trabalho foi realizado no laboratório da Disciplina de Fisiologia da Nutrição, da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais seguiram as regras estabelecidas pelo guia de Princípios éticos e práticos de uso de animais de laboratório (Andersen
et al., 2004) e foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP
(Projeto nº 0743/06).
1. ANIMAIS
Foram utilizados ratos machos da linhagem Wistar, procedentes do CEDEME (Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais da UNIFESP) e mantidos no biotério da Disciplina de Fisiologia da Nutrição da UNIFESP, em temperatura constante de 24±10C e período claro-escuro de 12/12 horas, com alimentação e água ad libitum.
2. GRUPOS EXPERIMENTAIS
Os animais recém desmamados (quatro semanas de idade) foram separados em três grupos tendo, durante sete semanas, livre acesso a um dos três tipos de dietas: dieta padrão (Labina - Purina) contendo 4% de gordura e 20% de proteína (Grupo Controle), dieta padrão enriquecida com 15% de óleo de Soja, rica em AGP Omega 6 (Grupo Soja), ou 15% de óleo de Peixe, rica em AGP Omega 3 (Grupo Peixe). As dietas ricas em AGP Omega 6 ou Omega 3 foram acrescidas com caseína, padronizando-se em 20 % o conteúdo de proteína.
3. PREPARAÇÃO DAS DIETAS E ARMAZENAMENTO
A ração Labina (Purina – Nestlé Purina Pet Care Company Brazil, Indústria Brasileira) foi moída e acrescida de caseína em pó e 15% de óleo de Soja (Grupo Soja) ou 15% de óleo de Peixe (Grupo Peixe). Após a homogeneização manual destes ingredientes, adicionamos água em quantidade que nos permitiu uma consistência adequada para a formatação da mistura em “pellets” que foram colocados em estufa com ventilação forçada, à temperatura de 600C para evaporação da água. Uma vez preparada, a ração foi armazenada e congelada a – 20 0C, sendo oferecida em porções diárias aos animais.
4. PROTOCOLO DE IMUNIZAÇÃO
Na quarta semana de alimentação os animais dos grupos Salina, Controle, Soja e Peixe, foram sensibilizados no dia zero e no sétimo dia, por injeção intraperitoneal (i.p.) da mistura que continha 10µg de OVA grau II e 10mg de hidróxido de alumínio em salina (volume total de 0,7mL). No décimo quarto e no vigésimo dia os animais foram desafiados por exposição ao aerosol de OVA grau II (2,5%) em salina, gerado por um nebulizador ultrassônico que liberava partículas de 0,5-1,0 diâmetro durante 20 minutos, com excessão do grupo Salina, que foi inalado somente com salina. Esse procedimento foi adaptado de Gama Landgraf e colaboradores (2003).
Vinte e quatro horas após o último desafio antigênico os animais foram anestesiados com Ketamina/Xilazina (1:1) (0,1mL por 100g de peso), a traquéia canulada, os pulmões infundidos três vezes com 4 mL de PBS estéril e o efluente (LBA) coletado em tubos imersos em gelo, centrifugado a 1200 r.p.m., por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante aliquotado foi armazenado a –80 ºC. O precipitado de células, mantido em gelo, foi utilizado para a contagem total e diferencial de células.
O lobo esquerdo do pulmão de alguns animais foi imerso em formaldeído a 10% e separado para análise histológica. Para a determinação de BK, o lobo esquerdo de outros animais foi congelado em nitrogênio líquido.
O lobo direito foi pesado e imerso em gelo, em tubos contendo PBS, submetido à homogeneização (Politron) e centrifugação a 2500 r.p.m., por 10 minutos, a 4 0C. O sobrenadante foi aliquotado e congelado a –800C. As amostras de LBA e homogenizado pulmonar foram utilizadas para determinação de citocinas, LTB4, LXA4, NO, BK e corticosterona.
6. CONTAGEM TOTAL E DIFERENCIAL DE CÉLULAS
O precipitado do LBA foi ressuspendido em 2,5 mL de PBS. Para cada 45 µL dessa suspensão celular, foi adicionado 5µL de cristal violeta a 0,5% (dissolvido em 30% de ácido acético) e o número total de células contado em câmara de Neubauer. A seguir, volumes de 100 e 200µL eram pipetados em cubetas de centrífuga de células (Citospin 3-Shandon) para a contagem diferencial de células. Essas amostras foram centrifugadas a 500 r.p.m., durante
5 minutos. A contagem diferencial foi relizada por um patologista após coloração com Kit - Instant Prov, utilizando-se a técnica de Hematoxilina-Eosina.
7. ANÁLISE HISTOLÓGICA
Fragmentos de pulmão obtidos 24 horas após o desafio antigênico foram fixados em formol a 10%, durante 24 horas. As amostras eram retiradas da região correspondente ao maior eixo longitudinal dos pulmões. Os fragmentos foram incluídos em parafina e seccionados em cortes de 5µm de espessura. De cada amostra eram confeccionados dois cortes, com intervalos de 30µm entre um e outro.
As preparações foram coradas pela técnica de Hematoxilina-Eosina e posteriormente examinadas. A avaliação histológica, feita por um patologista, duplo cego, baseada na intensidade do infiltrado inflamatório em áreas selecionadas ao redor dos vasos e bronquíolos de acordo com o grau de inflamação. Foi utilizada a seguinte escala: leve (1), moderado (2) e intenso (3), sendo que os números representam o que foi chamado de intensidade de inflamação (II).
8. DETERMINAÇÃO DE CITOCINAS, LTB4, LXA4, ÓXIDO NÍTRICO, CORTICOSTERONA E BRADICININA
As concentrações das citocinas, TNF-α, IFN-γ, IL-4, do LTB4, da LXA4 e da corticosterona no LBA e no homogenizado pulmonar foram determinadas através de reação de ELISA, utilizando-se kits R&D Systems, USbio e Cayman, respectivamente, específicos para rato.
A concentração de NO, no LBA e homogeneizado pulmonar, foi avaliada pelo método quimioluminescente, de acordo com Hampl e colaboradores (1996), ulitlizando-se o Nitric Oxide Analyzer (NOA).
A BK foi quantificada no LBA e homogeneizado pulmonar por HPLC e comparada ao peptídeo padrão, de acordo com o método descrito por Casarini e colaboradores (1992) modificado. A extração da BK dos tecidos foi realizada em colunas C18 Sep-Pak previamente ativadas com Acetonitrila 90% (2mL), água (5 mL) e 5% de Acetonitrila em 1% de ácido ortofosfórico (5mL). Após a ativação, as amostras eram aplicadas nas colunas, lavadas com 5% de acetonitrila em 1% de ácido ortofosfórico e eluidas em 35% de acetonitrila em 1% de ácido ortofosfórico. Os eluatos foram então liofilizados, redissolvidos em 500µL de fase móvel A (5% de acetonitrila em 0,1% de ácido ortofosfórico) e filtrados com membrana 0,22 m para serem analisados por HPLC.
Os peptídeos foram separados em uma coluna de fase reversa, Aquapore ODS 300 (250 x 4,6 mm), por 5 minutos com gradiente isocrático seguidos por 20 minutos de gradiente linear de 5% a 35% de fase móvel B (95% Acetonitrila em H3PO4 0,1%), sob um fluxo de 1,5 mL/min, por 40 minutos. As cininas de cada amostra eram identificadas, comparando-as com o tempo de retenção das cininas padrões.
9. IMUNOHISTOQUÍMICA PARA IL-5 PELO MÉTODO DE IMUNOPEROXIDASE
Para a análise da expressão de IL-5 no pulmão, os animais, 24 horas após o último desafio antigênico, foram anestesiados com Ketamina/Xilazina i.p. (1:1) (0,1mL por 100g de peso) e os pulmões perfundidos por via cardíaca com salina (150 mL), seguida de uma solução de paraformaldeido a 4% (fixador) em PBS (pH
7,4), a 4 ºC. Imediatamente após a perfusão, o lobo esquerdo do pulmão foi removido e fixado com paraformaldeido a 4% em PBS 100mM por 48 horas. A seguir foi imerso, por cerca de 12 horas, em solução de sacarose a 30% em PBS 0,05M, a 4ºC, para crioproteção. O pulmão foi então seccionado em cortes coronais de 45µm de espessura, em criostato.
Os cortes soltos em banho (free-floating) foram inicialmente pré-tratados com 0,3% de peróxido de hidrogênio por 15 minutos, e em seguida incubados com PBS, acrescido de albumina 2% e Triton X-100 0,3% (tampão de bloqueio) por duas horas. A seguir os cortes foram incubados com anticorpo primário anti-IL-5 (R&D System), feito em coelho, na concentração de 50 µg/mL, diluído em tampão de bloqueio, por 48 horas. Após esse período os cortes foram submetidos à nova incubação com anticorpo secundário biotinilado (1:200, anti-coelho feito em cabra, Sigma) diluído em tampão de bloqueio, por 90 minutos, em temperatura ambiente. Os cortes eram então tratados com ABC (complexo avidina-biotina, Vector 1:100) por 90 minutos. O complexo formado foi visualizado com diaminobenzina (Sigma) acrescido de 0,03% de níquel.
Durante todo o processamento, os cortes eram submetidos à agitação, assim como a três lavagens (no mínimo) de 5 minutos em PBS entre cada passo descrito. Os cortes foram montados em lâminas gelatinadas, secos, desidratados e cobertos com lamínula. O Controle negativo da expressão da IL-5 foi obtido a partir da eliminação do anticorpo primário do protocolo.
As lâminas foram analisadas em microscopia de campo claro para quantificação das células imunorreativas para IL-5 (IL-5-IR). As imagens foram capturadas através de um sistema de análise computadorizada consistindo de um microscópio (Nikon, Eclipse E600) conectado a uma câmera digital (CCD VIDEO CAMERA, EXWAVE HD, SONY - USA).
Para a quantificação das células IL-5-IR, utilizou-se uma grade quadriculada de 1mm2 posicionada na objetiva do microscópio. A grade era subdividida em quadrados de 0,05mm2. A calibração da área dos quadrados da grade foi feita utilizando-se uma régua de 5mm com subdivisões de 100µm. No aumento de 200X, a contagem celular foi feita em dois campos de maior celularidade, sendo utilizada a média dessa contagem. Para o Controle citoarquitetônico, outra série de cortes de cada animal dos grupos Controle, Soja e Peixe foram corados por Hematoxilina- Eeosina.
11. ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada com o auxílio software GraphPad Prisma versão 4. Para comparação entre os grupos Controle, Soja e Peixe utilizando-se a Análise de Variância de Kruskall-Wallis, seguida pelo teste de Dunn, sendo o nível mínimo de significância estabelecido em 5%. Os dados estão apresentados como média ± erro padrão da média.