• Sonuç bulunamadı

MCF- 7, HEPG2 ve HEK293 Hücrelerinden Saflaştırılan Total RNA Örneklerinden Oluşturulan cDNA’ların Agaroz Jel Görüntüleri

Derişim 1 Reaksiyon (µL)

4. BULGULAR

4.8. MCF- 7, HEPG2 ve HEK293 Hücrelerinden Saflaştırılan Total RNA Örneklerinden Oluşturulan cDNA’ların Agaroz Jel Görüntüleri

% 2’lik agaroz jele yüklenen cDNA örneklerinin 100 V’da 30 dakika süre ile yürütülmesinden sonra jel 1 X SYBR Gold ile boyanmış ve inkübe edilmiştir.

İnkübasyon süresinden sonunda jelin fotoğrafı çekilmiş ve cDNA örneklerinin bir örnek dışında başarılı bir şekilde oluşturulduğu gösterilmiştir.

Şekil 4.7’de M: DNA belirtecini, 7B: 50 nM DOX uygulanmış MCF-7, 4A:

400 nM DOX uygulanmış HEPG2, 1B: hiç DOX uygulanmamış HEPG2, 5A: 800 nM DOX uygulanmış HEPG2, 6A: 200 nM DOX uygulanmış MCF-7, 11C: hiç

DOX uygulaması yapılmamış HEK293 ve 14C ise 400 nM DOX uygulanmış HEK293 hücrelerinden saflaştırılan RNA’lardan oluşturulan cDNA örneklerini temsil etmektedir.

Şekil 4.7. MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücrelerinden saflaştırılan total RNA örneklerinden oluşturulan cDNA’ların agaroz jel görüntüleri.

4.9. MCF-7, HEPG2 ve HEK293 Hücrelerinde TP53, MDM2, BCL-2, BAX ve MDR-1 Genlerinin Ekspresyon Düzeyi Sonuçları

Hiç DOX uygulaması yapılmamış ya da artan dozlarda DOX uygulanmış olan MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücrelerinde TP53, MDM2, BCL-2, BAX ve MDR-1 genlerinin ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi amacıyla RT-PCR işleminden yararlanılmış ve kontrol gen olarak GAPDH seçilmiştir.

BAX dışında her bir gen, her bir hücre hattı için n=3 olacak şekilde çalışılmıştır. Sonuçların ortalama ve standart sapmaları alınmış ve GraphPad grafik programı yardımıyla gen ekspresyon grafikleri çizilmiştir.

Şekil 4.8’de her bir hücre hattı için TP53 geninin ekspresyon düzeylerinde, DOX’un artan dozlarına bağlı gözlenen değişiklikler grafik halinde sunulmuştur.

Tablo 4.3’te ise her bir hücre hattı için ayrı ayrı TP53 gen ekspresyon düzeylerinin ortalaması ve standart sapması verilmiştir.

M 7B 4A 1B 5A 6A 11C 14C

Şekil 4.8. (A) MCF-7, (B) HEPG2 ve (C) HEK293 hücrelerinde TP53 ekspresyon düzeyleri grafiği (n=3).

Tablo 4.3. MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücrelerinde TP53 geninin ekspresyon düzeylerinin ortalaması ve standart sapması.

DOX (nM) Hücre Hattı Ortalama Standart Sapma

0

MCF-7 1,000 0,000

HEPG2 1,000 0,000

HEK293 1,000 0,000

50

MCF-7 1,677 0,087

HEPG2 2,539 1,359

HEK293 0,618 0,135

200

MCF-7 0,959 0,119

HEPG2 2,536 1,431

HEK293 0,215 0,082

400

MCF-7 0,157 0,109

HEPG2 1,590 1,692

HEK293 0,387 0,055

800

MCF-7 0,208 0,004

HEPG2 0,009 0,009

HEK293 ̶ ̶

MCF-7 hücrelerinde 50 nM DOX uygulamasının ardından TP53 geninin ekspresyon düzeyinde 1,7 kat artış gözlenirken 200, 400 ve 800 nM DOX uygulaması sonrasında çarpıcı bir şekilde azalmıştır. En belirgin azalma 400 nM DOX uygulamasından sonra gözlenmiştir.

HEPG2 hücrelerinde 50 nM ve 200 nM DOX uygulaması sonrasında TP53 geninin ekspresyon düzeyi kontrol ile karşılaştırıldığında 2,5 kat artarken; bu artış 400 nM DOX uygulamasının ardından 1,5 kat olacak şekilde gözlenmiştir. 800 nM DOX uygulanmış HEPG2 hücrelerinde ise bu genin ekspresyon düzeyi çarpıcı şekilde azalmıştır.

HEK293 hücrelerinde DOX uygulaması sonrasında TP53 geninin ekspresyon düzeyinde doza bağlı olmayan bir azalma gözlenmiş; 800 nM DOX uygulamasının ardından ise ekspresyon düzeyi ölçülemeyecek kadar düşük çıkmıştır.

Şekil 4.9’da MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücrelerinde artan dozlarda DOX uygulamasına bağlı olarak MDM2’nin ekspresyon düzeyleri grafik halinde verilmiştir.

Tablo 4.4’te ise her bir hücre hattı için ayrı ayrı MDM2 geninin ekspresyon düzeyinin doza bağlı olarak değişiminin ortalaması ve standart sapması verilmiştir.

Şekil 4.9. (A) MCF-7, (B) HEPG2 ve (C) HEK293 hücrelerinde MDM2 geninin ekspresyon düzeyleri grafiği (n=3).

A B C

Tablo 4.4. MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücrelerinde MDM2 geninin ekspresyon düzeylerinin ortalaması ve standart sapması.

DOX (nM) Hücre Hattı Ortalama Standart Sapma 0

MCF-7 1,000 0,000

HEPG2 1,000 0,000

HEK293 1,000 0,000

50

MCF-7 0,995 0,263

HEPG2 2,093 2,257

HEK293 1,054 0,010

200

MCF7 0,991 0,263

HEPG2 0,718 0,315

HEK293 0,179 0,012

400

MCF-7 0,227 0,002

HEPG2 0,617 0,234

HEK293 0,047 0,014

800

MCF-7 0,229 0,002

HEPG2 0,454 0,063

HEK293 0,162 0,017

MCF-7 hücrelerinde MDM2 geninin ekspresyon düzeyi, 50 ve 200 nM DOX uygulamasının ardından kontrole göre göreceli aynı kalmıştır. 400 ve 800 nM DOX uygulamasından sonra ise bu genin ekspresyon düzeyinde belirgin bir azalma gözlemlenmiştir.

Artan dozlarda DOX uygulaması yapılmış HEPG2 hücrelerinde MDM2 geninin ekspresyon düzeyi kontrole göre karşılaştırıldığında 50 nM DOX uygulamasının ardından ekspresyon düzeyinin 2,093 kat arttığı; diğer dozlarda ise kademeli olarak azaldığı görülmüştür.

HEK293 hücrelerinde MDM2’nin ekspresyon düzeyi 50 nM DOX uygulamasının ardından kontrole göre göreceli aynı kalmış; 200 nM, 400 nM ve 800 nM DOX uygulamasının adından dozdan bağımsız olarak çarpıcı bir şekilde azalmıştır. Bu azalma en belirgin şekilde 400 nM DOX uygulamasının ardından gözlemlenmiştir.

Şekil 4.10’da MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücrelerinde artan dozlarda DOX uygulamasına bağlı olarak BCL-2 geninin ekspresyon düzeyleri grafik halinde verilmiştir.

Tablo 4.5’de ise her bir hücre hattı için ayrı ayrı BCL-2’nin ekspresyon düzeyinin doza bağlı olarak değişiminin ortalaması ve standart sapması verilmiştir.

Şekil 4.10. (A) MCF-7, (B) HEPG2 ve (C) HEK293 hücrelerinde BCL-2 geninin ekspresyon düzeyleri grafiği (n=3).

Tablo 4.5. MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücrelerinde BCL-2 geninin ekspresyon düzeylerinin ortalaması ve standart sapması.

DOX (nM) Hücre Hattı Ortalama Standart Sapma 0

MCF-7 1,000 0,000

HEPG2 1,000 0,000

HEK293 1,000 0,000

50

MCF-7 0,665 0,405

HEPG2 2,644 2,278

HEK293 0,86 ̶

200

MCF-7 0,345 0,268

HEPG2 1,666 1,060

HEK293 0,111 ̶

400

MCF-7 0,088 0,028

HEPG2 0,771 0,311

HEK293 0,118 0,164

800

MCF-7 0,169 0,104

HEPG2 0,472 0,231

HEK293 0,062 ̶

MCF-7 hücrelerinde BCL-2 geninin ekspresyon düzeyi, artan DOX dozuyla birlikte ters orantılı olarak azalmıştır. Bu azalma en belirgin şekilde 400 nM DOX uygulaması yapılmış olan hücrelerde gözlemlenmiştir.

HEPG2 hücrelerinde artan DOX dozu ile birlikte BCL-2 geninin ekspresyon düzeyinde gözlenen değişiklikler kontrol ile karşılaştırıldığında 50 nM DOX uygulamasından sonra bu genin ekspresyon düzeyinin 2,644 kat artarken; 200 nM DOX uygulamasından sonra 1,666 kat arttığı görülmüştür. 400 ve 800 nM ilaç

A B C

uygulanmasından sonra ise genin ekspresyon düzeyinde kontrole göre bir azalma tespit edilmiştir.

HEK293 hücrelerinde BCL-2 ekspresyon düzeyleri n=3 olacak şekilde ölçülmediğinden bütün veriler için standart sapma hesaplanamamıştır. Elde edilen sonuçlara göre BCL-2 geninin ekspresyon düzeyi bu hücrelerde DOX dozunun artmasından bağımsız bir şeklide azalma göstermiştir.

Şekil 4.11’de MCF-7 ve HEPG2 hücrelerinde artan dozlarda DOX uygulamasına bağlı olarak BAX’ın ekspresyon düzeyleri grafik halinde sunulmuştur.

Tablo 4.6’da ise bu iki hücre hattı için ayrı ayrı BAX geninin ekspresyon düzeyinin doza bağlı olarak değişiminin ortalaması ve standart sapması verilmiştir.

Şekil 4.11. (A) MCF-7 ve (B) HEPG2 hücrelerinde BAX geninin ekspresyon düzeyleri grafiği (n=3).

Tablo 4.6. MCF-7 ve HEPG2 hücrelerinde BAX geninin ekspresyon düzeylerinin ortalaması ve standart sapması.

DOX (nM) Hücre Hattı Ortalama Standart Sapma

0 MCF-7 1,000 0,000

HEPG2 1,000 0,000

50 MCF-7 1,672 0,124

HEPG2 2,380 2,556

200 MCF-7 2,573 0,400

HEPG2 1,611 0,358

400 MCF-7 0,244 0,135

HEPG2 1,156 0,233

800 MCF-7 0,345 0,262

HEPG2 1,229 0,695

A B

MCF-7 hücrelerinde artan dozlarda DOX uygulanmasıyla birlikte BAX geninin ekspresyon düzeyi 50 nM DOX uygulamasının ardından kontrole göre 1,672 kat; 200 nM DOX uygulamasının ardından ise 2,573 kat artmıştır. 400 ve 800 nM DOX uygulamasından sonra ise BCL-2’nin ekspresyon düzeyi dramatik bir şekilde azalma göstermiştir.

HEPG2 hücrelerinde BAX geninin ekspresyon düzeyi incelendiğinde 50 nM DOX uygulanmasından sonra kontrole göre 2,380 kat bir artış gözlenirken; 200 nM DOX uygulamasının ardından ise 1,611 kat bir artış tespit edilmiştir. 400 ve 800 nM DOX uygulanan hücrelerdeki BAX ekspresyon düzeylerinin ise kontrole göre göreceli aynı kaldığı gözlemlenmiştir. HEK293 hücrelerinde artan DOX dozlarına bağlı olarak BAX geninin ekspresyon düzeylerindeki kontrole göre değişikliklere bakılmamıştır.

Şekil 4.12’de MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücrelerinde artan dozlarda DOX uygulamasına bağlı olarak çoklu ilaç direnci geni MDR-1’in ekspresyon düzeyleri grafik halinde sunulmuştur.

Tablo 4.7’de ise her bir hücre hattı için ayrı ayrı MDR-1 geninin ekspresyon düzeyinin doza bağlı olarak değişiminin ortalaması ve standart sapması verilmiştir.

Şekil 4.12. (A) MCF-7, (B) HEPG2 ve (C) HEK293 hücrelerinde MDR-1 geninin ekspresyon düzeyleri grafiği (n=3).

A B C

Tablo 4.7. MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücrelerinde MDR-1 geninin ekspresyon düzeylerinin ortalaması ve standart sapması.

DOX (nM) Hücre Hattı Ortalama Standart Sapma

0

MCF-7 1,000 0,000

HEPG2 1,000 0,000

HEK293 1,000 0,000

50

MCF-7 0,905 0,560

HEPG2 0,824 0,192

HEK293 2,057 0,617

200

MCF-7 0,685 0,445

HEPG2 0,778 0,369

HEK293 4,181 3,602

400

MCF-7 0,131 0,122

HEPG2 0,743 0,320

HEK293 45,072 12,377

800

MCF-7 0,119 0,089

HEPG2 0,747 0,231

HEK293 84,790 12,850

MCF-7 hücrelerinde artan DOX dozuna bağlı olarak MDR-1 geninin ekspresyon düzeyindeki değişiklikler kontrol ile karşılaştırıldığında, bu genin ekspresyon düzeyi, 50 nM DOX dozunun uygulanmasının ardından göreceli aynı kalmıştır. 200 nM DOX dozunun uygulanmasından sonra azalmış; 400 ve 800 nM DOX dozlarının uygulanmasının ardından ise bu azalma daha belirgin biçimde gözlemlenmiştir.

HEPG2 hücrelerinde MDR-1 geninin ekspresyon düzeyinde gözlenen ilaç dozuna bağlı değişikliklerin kontrole göre kıyaslanması sonucunda, DOX dozundan bağımsız bir şekilde belirgin bir değişiklik gözlenmemiş; göreceli olarak aynı kalmıştır.

HEK293 hücrelerinde MDR-1 geninin ekspresyon düzeyi incelendiğinde uygulanan DOX dozundaki artış ile ekspresyon düzeyinin çarpıcı şekilde arttığı ve

bu artışın 800 nM DOX dozunun uygulanmasının ardından kontrole kıyasla yaklaşık 85 kata ulaştığı gözlemlenmiştir.

Şekil 4.13, Şekil 4.14 ve Şekil 4.15’de sırasıyla MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücre hatlarında, gen ekspresyon düzeyleri incelenen bütün genlerin bir arada gösterildiği grafikler sunulmuştur.

Şekil 4.13. MCF-7 hücrelerinde gen ekspresyon düzeyleri (n=3).

Şekil 4.14. HEPG2 hücrelerinde gen ekspresyon düzeyleri (n=3).

Şekil 4.15. HEK293 hücrelerinde gen ekspresyon düzeyleri (n=3).

Benzer Belgeler