Derişim 1 Reaksiyon (µL)
4. BULGULAR
4.8. MCF- 7, HEPG2 ve HEK293 Hücrelerinden Saflaştırılan Total RNA Örneklerinden Oluşturulan cDNA’ların Agaroz Jel Görüntüleri
% 2’lik agaroz jele yüklenen cDNA örneklerinin 100 V’da 30 dakika süre ile yürütülmesinden sonra jel 1 X SYBR Gold ile boyanmış ve inkübe edilmiştir.
İnkübasyon süresinden sonunda jelin fotoğrafı çekilmiş ve cDNA örneklerinin bir örnek dışında başarılı bir şekilde oluşturulduğu gösterilmiştir.
Şekil 4.7’de M: DNA belirtecini, 7B: 50 nM DOX uygulanmış MCF-7, 4A:
400 nM DOX uygulanmış HEPG2, 1B: hiç DOX uygulanmamış HEPG2, 5A: 800 nM DOX uygulanmış HEPG2, 6A: 200 nM DOX uygulanmış MCF-7, 11C: hiç
DOX uygulaması yapılmamış HEK293 ve 14C ise 400 nM DOX uygulanmış HEK293 hücrelerinden saflaştırılan RNA’lardan oluşturulan cDNA örneklerini temsil etmektedir.
Şekil 4.7. MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücrelerinden saflaştırılan total RNA örneklerinden oluşturulan cDNA’ların agaroz jel görüntüleri.
4.9. MCF-7, HEPG2 ve HEK293 Hücrelerinde TP53, MDM2, BCL-2, BAX ve MDR-1 Genlerinin Ekspresyon Düzeyi Sonuçları
Hiç DOX uygulaması yapılmamış ya da artan dozlarda DOX uygulanmış olan MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücrelerinde TP53, MDM2, BCL-2, BAX ve MDR-1 genlerinin ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi amacıyla RT-PCR işleminden yararlanılmış ve kontrol gen olarak GAPDH seçilmiştir.
BAX dışında her bir gen, her bir hücre hattı için n=3 olacak şekilde çalışılmıştır. Sonuçların ortalama ve standart sapmaları alınmış ve GraphPad grafik programı yardımıyla gen ekspresyon grafikleri çizilmiştir.
Şekil 4.8’de her bir hücre hattı için TP53 geninin ekspresyon düzeylerinde, DOX’un artan dozlarına bağlı gözlenen değişiklikler grafik halinde sunulmuştur.
Tablo 4.3’te ise her bir hücre hattı için ayrı ayrı TP53 gen ekspresyon düzeylerinin ortalaması ve standart sapması verilmiştir.
M 7B 4A 1B 5A 6A 11C 14C
Şekil 4.8. (A) MCF-7, (B) HEPG2 ve (C) HEK293 hücrelerinde TP53 ekspresyon düzeyleri grafiği (n=3).
Tablo 4.3. MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücrelerinde TP53 geninin ekspresyon düzeylerinin ortalaması ve standart sapması.
DOX (nM) Hücre Hattı Ortalama Standart Sapma
0
MCF-7 1,000 0,000
HEPG2 1,000 0,000
HEK293 1,000 0,000
50
MCF-7 1,677 0,087
HEPG2 2,539 1,359
HEK293 0,618 0,135
200
MCF-7 0,959 0,119
HEPG2 2,536 1,431
HEK293 0,215 0,082
400
MCF-7 0,157 0,109
HEPG2 1,590 1,692
HEK293 0,387 0,055
800
MCF-7 0,208 0,004
HEPG2 0,009 0,009
HEK293 ̶ ̶
MCF-7 hücrelerinde 50 nM DOX uygulamasının ardından TP53 geninin ekspresyon düzeyinde 1,7 kat artış gözlenirken 200, 400 ve 800 nM DOX uygulaması sonrasında çarpıcı bir şekilde azalmıştır. En belirgin azalma 400 nM DOX uygulamasından sonra gözlenmiştir.
HEPG2 hücrelerinde 50 nM ve 200 nM DOX uygulaması sonrasında TP53 geninin ekspresyon düzeyi kontrol ile karşılaştırıldığında 2,5 kat artarken; bu artış 400 nM DOX uygulamasının ardından 1,5 kat olacak şekilde gözlenmiştir. 800 nM DOX uygulanmış HEPG2 hücrelerinde ise bu genin ekspresyon düzeyi çarpıcı şekilde azalmıştır.
HEK293 hücrelerinde DOX uygulaması sonrasında TP53 geninin ekspresyon düzeyinde doza bağlı olmayan bir azalma gözlenmiş; 800 nM DOX uygulamasının ardından ise ekspresyon düzeyi ölçülemeyecek kadar düşük çıkmıştır.
Şekil 4.9’da MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücrelerinde artan dozlarda DOX uygulamasına bağlı olarak MDM2’nin ekspresyon düzeyleri grafik halinde verilmiştir.
Tablo 4.4’te ise her bir hücre hattı için ayrı ayrı MDM2 geninin ekspresyon düzeyinin doza bağlı olarak değişiminin ortalaması ve standart sapması verilmiştir.
Şekil 4.9. (A) MCF-7, (B) HEPG2 ve (C) HEK293 hücrelerinde MDM2 geninin ekspresyon düzeyleri grafiği (n=3).
A B C
Tablo 4.4. MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücrelerinde MDM2 geninin ekspresyon düzeylerinin ortalaması ve standart sapması.
DOX (nM) Hücre Hattı Ortalama Standart Sapma 0
MCF-7 1,000 0,000
HEPG2 1,000 0,000
HEK293 1,000 0,000
50
MCF-7 0,995 0,263
HEPG2 2,093 2,257
HEK293 1,054 0,010
200
MCF7 0,991 0,263
HEPG2 0,718 0,315
HEK293 0,179 0,012
400
MCF-7 0,227 0,002
HEPG2 0,617 0,234
HEK293 0,047 0,014
800
MCF-7 0,229 0,002
HEPG2 0,454 0,063
HEK293 0,162 0,017
MCF-7 hücrelerinde MDM2 geninin ekspresyon düzeyi, 50 ve 200 nM DOX uygulamasının ardından kontrole göre göreceli aynı kalmıştır. 400 ve 800 nM DOX uygulamasından sonra ise bu genin ekspresyon düzeyinde belirgin bir azalma gözlemlenmiştir.
Artan dozlarda DOX uygulaması yapılmış HEPG2 hücrelerinde MDM2 geninin ekspresyon düzeyi kontrole göre karşılaştırıldığında 50 nM DOX uygulamasının ardından ekspresyon düzeyinin 2,093 kat arttığı; diğer dozlarda ise kademeli olarak azaldığı görülmüştür.
HEK293 hücrelerinde MDM2’nin ekspresyon düzeyi 50 nM DOX uygulamasının ardından kontrole göre göreceli aynı kalmış; 200 nM, 400 nM ve 800 nM DOX uygulamasının adından dozdan bağımsız olarak çarpıcı bir şekilde azalmıştır. Bu azalma en belirgin şekilde 400 nM DOX uygulamasının ardından gözlemlenmiştir.
Şekil 4.10’da MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücrelerinde artan dozlarda DOX uygulamasına bağlı olarak BCL-2 geninin ekspresyon düzeyleri grafik halinde verilmiştir.
Tablo 4.5’de ise her bir hücre hattı için ayrı ayrı BCL-2’nin ekspresyon düzeyinin doza bağlı olarak değişiminin ortalaması ve standart sapması verilmiştir.
Şekil 4.10. (A) MCF-7, (B) HEPG2 ve (C) HEK293 hücrelerinde BCL-2 geninin ekspresyon düzeyleri grafiği (n=3).
Tablo 4.5. MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücrelerinde BCL-2 geninin ekspresyon düzeylerinin ortalaması ve standart sapması.
DOX (nM) Hücre Hattı Ortalama Standart Sapma 0
MCF-7 1,000 0,000
HEPG2 1,000 0,000
HEK293 1,000 0,000
50
MCF-7 0,665 0,405
HEPG2 2,644 2,278
HEK293 0,86 ̶
200
MCF-7 0,345 0,268
HEPG2 1,666 1,060
HEK293 0,111 ̶
400
MCF-7 0,088 0,028
HEPG2 0,771 0,311
HEK293 0,118 0,164
800
MCF-7 0,169 0,104
HEPG2 0,472 0,231
HEK293 0,062 ̶
MCF-7 hücrelerinde BCL-2 geninin ekspresyon düzeyi, artan DOX dozuyla birlikte ters orantılı olarak azalmıştır. Bu azalma en belirgin şekilde 400 nM DOX uygulaması yapılmış olan hücrelerde gözlemlenmiştir.
HEPG2 hücrelerinde artan DOX dozu ile birlikte BCL-2 geninin ekspresyon düzeyinde gözlenen değişiklikler kontrol ile karşılaştırıldığında 50 nM DOX uygulamasından sonra bu genin ekspresyon düzeyinin 2,644 kat artarken; 200 nM DOX uygulamasından sonra 1,666 kat arttığı görülmüştür. 400 ve 800 nM ilaç
A B C
uygulanmasından sonra ise genin ekspresyon düzeyinde kontrole göre bir azalma tespit edilmiştir.
HEK293 hücrelerinde BCL-2 ekspresyon düzeyleri n=3 olacak şekilde ölçülmediğinden bütün veriler için standart sapma hesaplanamamıştır. Elde edilen sonuçlara göre BCL-2 geninin ekspresyon düzeyi bu hücrelerde DOX dozunun artmasından bağımsız bir şeklide azalma göstermiştir.
Şekil 4.11’de MCF-7 ve HEPG2 hücrelerinde artan dozlarda DOX uygulamasına bağlı olarak BAX’ın ekspresyon düzeyleri grafik halinde sunulmuştur.
Tablo 4.6’da ise bu iki hücre hattı için ayrı ayrı BAX geninin ekspresyon düzeyinin doza bağlı olarak değişiminin ortalaması ve standart sapması verilmiştir.
Şekil 4.11. (A) MCF-7 ve (B) HEPG2 hücrelerinde BAX geninin ekspresyon düzeyleri grafiği (n=3).
Tablo 4.6. MCF-7 ve HEPG2 hücrelerinde BAX geninin ekspresyon düzeylerinin ortalaması ve standart sapması.
DOX (nM) Hücre Hattı Ortalama Standart Sapma
0 MCF-7 1,000 0,000
HEPG2 1,000 0,000
50 MCF-7 1,672 0,124
HEPG2 2,380 2,556
200 MCF-7 2,573 0,400
HEPG2 1,611 0,358
400 MCF-7 0,244 0,135
HEPG2 1,156 0,233
800 MCF-7 0,345 0,262
HEPG2 1,229 0,695
A B
MCF-7 hücrelerinde artan dozlarda DOX uygulanmasıyla birlikte BAX geninin ekspresyon düzeyi 50 nM DOX uygulamasının ardından kontrole göre 1,672 kat; 200 nM DOX uygulamasının ardından ise 2,573 kat artmıştır. 400 ve 800 nM DOX uygulamasından sonra ise BCL-2’nin ekspresyon düzeyi dramatik bir şekilde azalma göstermiştir.
HEPG2 hücrelerinde BAX geninin ekspresyon düzeyi incelendiğinde 50 nM DOX uygulanmasından sonra kontrole göre 2,380 kat bir artış gözlenirken; 200 nM DOX uygulamasının ardından ise 1,611 kat bir artış tespit edilmiştir. 400 ve 800 nM DOX uygulanan hücrelerdeki BAX ekspresyon düzeylerinin ise kontrole göre göreceli aynı kaldığı gözlemlenmiştir. HEK293 hücrelerinde artan DOX dozlarına bağlı olarak BAX geninin ekspresyon düzeylerindeki kontrole göre değişikliklere bakılmamıştır.
Şekil 4.12’de MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücrelerinde artan dozlarda DOX uygulamasına bağlı olarak çoklu ilaç direnci geni MDR-1’in ekspresyon düzeyleri grafik halinde sunulmuştur.
Tablo 4.7’de ise her bir hücre hattı için ayrı ayrı MDR-1 geninin ekspresyon düzeyinin doza bağlı olarak değişiminin ortalaması ve standart sapması verilmiştir.
Şekil 4.12. (A) MCF-7, (B) HEPG2 ve (C) HEK293 hücrelerinde MDR-1 geninin ekspresyon düzeyleri grafiği (n=3).
A B C
Tablo 4.7. MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücrelerinde MDR-1 geninin ekspresyon düzeylerinin ortalaması ve standart sapması.
DOX (nM) Hücre Hattı Ortalama Standart Sapma
0
MCF-7 1,000 0,000
HEPG2 1,000 0,000
HEK293 1,000 0,000
50
MCF-7 0,905 0,560
HEPG2 0,824 0,192
HEK293 2,057 0,617
200
MCF-7 0,685 0,445
HEPG2 0,778 0,369
HEK293 4,181 3,602
400
MCF-7 0,131 0,122
HEPG2 0,743 0,320
HEK293 45,072 12,377
800
MCF-7 0,119 0,089
HEPG2 0,747 0,231
HEK293 84,790 12,850
MCF-7 hücrelerinde artan DOX dozuna bağlı olarak MDR-1 geninin ekspresyon düzeyindeki değişiklikler kontrol ile karşılaştırıldığında, bu genin ekspresyon düzeyi, 50 nM DOX dozunun uygulanmasının ardından göreceli aynı kalmıştır. 200 nM DOX dozunun uygulanmasından sonra azalmış; 400 ve 800 nM DOX dozlarının uygulanmasının ardından ise bu azalma daha belirgin biçimde gözlemlenmiştir.
HEPG2 hücrelerinde MDR-1 geninin ekspresyon düzeyinde gözlenen ilaç dozuna bağlı değişikliklerin kontrole göre kıyaslanması sonucunda, DOX dozundan bağımsız bir şekilde belirgin bir değişiklik gözlenmemiş; göreceli olarak aynı kalmıştır.
HEK293 hücrelerinde MDR-1 geninin ekspresyon düzeyi incelendiğinde uygulanan DOX dozundaki artış ile ekspresyon düzeyinin çarpıcı şekilde arttığı ve
bu artışın 800 nM DOX dozunun uygulanmasının ardından kontrole kıyasla yaklaşık 85 kata ulaştığı gözlemlenmiştir.
Şekil 4.13, Şekil 4.14 ve Şekil 4.15’de sırasıyla MCF-7, HEPG2 ve HEK293 hücre hatlarında, gen ekspresyon düzeyleri incelenen bütün genlerin bir arada gösterildiği grafikler sunulmuştur.
Şekil 4.13. MCF-7 hücrelerinde gen ekspresyon düzeyleri (n=3).
Şekil 4.14. HEPG2 hücrelerinde gen ekspresyon düzeyleri (n=3).
Şekil 4.15. HEK293 hücrelerinde gen ekspresyon düzeyleri (n=3).