Elektroeğirme ile Üç Boyutlu (3B) PLGA/HA Doku İskelesi Üretimi ve

52 sıcaklık aralığındaki bu kütle kaybı HA partikülleri içerisindeki absorblanmış suyun yapı içerisinden uzaklaşmasından kaynaklanmaktadır. Isıl işlemin ilerleyen aşamalarında ise HA partikülleri kısmen kristalin forma geçtiğinden olduğu için yapıda

%1’den küçük bir oranda kütle kaybı meydana gelmiştir [138].

Şekil 4.4. Sentezlenen HA partiküllerine ait TGA grafiği.

4.1.2. Elektroeğirme ile Üç Boyutlu (3B) PLGA/HA Doku İskelesi Üretimi ve

53 Kemik doku mühendisliğinde en sık kullanılan sentetik polimerler Amerikan İlaç ve Gıda Dairesi (FDA) onaylı olan PCL, PLA, PGA ve PLGA’dır. Bu polimerler içerisinde en çok tercih edilen lineer bir polyester olan PLGA’dır [140]. Farklı laktik asit (LA)/glikolik asit (GA) oranlarında sentezlenebilen PLGA kopolimerleri, fizikokimyasal özellikler ve bozunma kinetiği açısından farklılıklar göstermektedir.

Doku mühendisliği çalışmalarında iskelenin bozunma hızının, yeni dokunun oluşumuyla eş zamanlı olması önemli bir gereksinimdir. Bu açıdan bakıldığında sentetik polimerler içerisinde PLGA kopolimerinin biyobozunma hızının monomerlerin miktarına bağlı olarak kontrol edilebilir olması, PLGA’yı kemik doku mühendisliği çalışmalarında en çok tercih edilen sentetik polimerlerden biri yapmaktadır. Artan GA oranı PLGA kopolimerlerini daha hidrofilik hale getirir ve bozunurluk hızlarını yüksektir. Örneğin, molce % 50 LA ve % 50 GA (50:50) oranındaki PLGA kopolimeri ortopedik tedaviler için uygun bir bozunma hızı (yaklaşık 1-2 ay) gösterir. PLGA’nın biyobozunurluğunu etkileyen diğer faktörler ise kopolimerdeki uç gruplar, bozunma pH’sı ve sıcaklıktır. Asit grubu (hidrofilik) ile sonlanan PLGA’nın, etil veya hekzil grubu (hidrofobik) ile sonlanan PLGA kopolimerinden 2-3 kat daha hızlı bozunma hızı gösterdiği bilinmektedir. Polimer uç gruplarına ek olarak PLGA, bazik ortama kıyasla asidik ortamda daha hızlı bozunma eğilimindedir ve yüksek sıcaklıkta daha hızlı bozunma gösterir. Biyobozunur olmasının yanı sıra, PLGA yüksek biyouyumluluğu sayesinde de rejeneratif tıp alanında en çok kullanılan sentetik polimerler durumundadır. Ancak, diğer sentetik polimerlerde olduğu gibi PLGA’nın da doğal polimerlere nazaran biyoaktivitesi düşüktür [23]. Bu olumsuzluğun giderilmesi için PLGA kopolimeri, yukarıda açıklandığı üzere sert doku mühendisliği uygulamalarına yönelik olarak HA gibi biyoseramik malzemelerle birleştirilmekte ve böylelikle biyolojik aktivitesi artırılmış kompozit malzemelere dönüştürülmektedir [22].

Sunulan tez çalışmasında, biyobozunurluk özellikleri, hidrofilisitesi ve şekillendirilebilme kolaylığı açısından optimum özelliklere sahip, kısa ve orta vadede kemik iyileşmesini sağlayacak LA ve GA oranı 50:50 olan PLGA kopolimeri doku iskelesinin temel matriksini oluşturmak üzere seçilmiştir. Polilaktik-ko-glikolik kopolimerinin osteokondüktif özelliklerinin artırılması için yapısına, biyomimetik yöntem ile sentezlenen HA partikülleri katılmıştır. PLGA/HA kompozitlerinin üretimi ve karakterizasyon çalışmaları aşağıda literatürle karşılaştırmalı olarak tartışılmıştır.

54 Elektroeğirme, biyobozunur polimerlerden fibröz doku iskelelerinin üretildiği bir fabrikasyon yöntemidir. Bu yöntemle içsel bağlantısı yüksek, gözenekli doku iskeleleri üretilmektedir. Çalışmalar bu yöntem ile üretilen mikro/nano ölçekteki fiberlerin hücre çoğalmasını ve farklılaşmasını desteklediğini göstermiştir [34]. Elektrostatik kuvvetlerin kullanıldığı bu yöntemde eğirme parametreleri, çözelti parametreleri ve toplayıcı geometrisi değiştirilerek 2B ve 3B gibi çeşitli formlarda doku iskeleleri üretilebilmektedir. Ancak 2B iskelelerin üretildiği geleneksel elektroeğirme yönteminde fiberler üst üste sıkı bir şekilde istiflenmektedir. Sonuç olarak, hücre penetrasyonu düşük ve sadece yüzeysel gözenekliliğe sahip doku iskeleleri oluşmaktadır. Bu nedenle çalışmalarda ECM yapısını daha iyi taklit edebilen 3B doku iskelelerin üretildiği elektroeğirme yöntemleri geliştirilmiştir [34].

Tez kapsamında, iki boyutlu üretim sonrası karşılaşılan malzeme yapısındaki sorunların üstesinden gelebilmek için, nanofibröz yapıda PLGA/HA kompozit doku iskeleleri, 3B üretim için uygun geometride bir toplayıcı kullanılan 3B elektroeğirme yöntemi ile üretilmiştir.

Kompozit 3B PLGA/HA nanofiber doku iskelelerine ait düşük ve yüksek büyütmelerdeki SEM görüntüleri Şekil 4.5’te verilmiştir. Ayrıca aynı şekilde karşılaştırma yapmak amacıyla, aynı koşullarda üretilen 2B PLGA/HA doku iskelelerine ait SEM görüntüleri de bulunmaktadır. Üretilen 3B PLGA/HA doku iskelelerine ait SEM görüntüleri, ImageJ programına aktarılmış ve nanofiberlerin gözenek büyüklükleri, ortalama çap değerleri hesaplanmıştır. PLGA ve PLGA/HA 3B doku iskelelerine ait ortalama çap ve çap dağılımları sırasıyla 299 ± 45 ve 316 ± 114 nm olarak hesaplanmıştır.Şekil 4.5.b ve d incelendiğinde 2B nanofiberlerin sıkı bir şekilde üst üste istiflendiği ve gözenek çaplarının 3B yapıdan daha küçük olduğu görülmektedir. Üç boyutlu PLGA/HA doku iskelelerindeki fiberler arasındaki boşluklar 10-20 µm arasında değişiyorken 2B doku iskelelerinde bu boşlukların büyük bir kısmı 10 µm’den küçüktür. Şekil 4.6.a’da geleneksel 2B elektroeğirmeye göre çok daha geniş bir alanda toplanan PLGA /HA nanofiberlere ait görüntü yer almıştır. Düz plaka iletken olmayan yarım daire şeklinde bir toplayıcı içerisine eğrilen PLGA/HA nanofiberleri bir iğne yardımıyla toplanarak 3B sıkıştıralabilir formda doku iskeleleri oluşturulmuştur.

55 Şekil 4.6.b.’de ise aynı süre ile (10 dk) eğrilmiş 2B ve 3B PLGA/HA doku iskelelerine ait görüntüler verilmiştir ve üretilen bu doku iskelelerinin kalınlıkları sırasıyla 50 µm ve 0.6 cm olarak ölçülmüştür. Sonuçlar, üretilen 3B PLGA/HA kompozit doku iskelelerinin, tez çalışmasının amacına uygun olarak geometrisi belli olmayan kemik hasarlarında kullanılabilen, sıkıştırılabilir ve kolay şekillenenilir formda doku iskelelerinin başarılı bir şekilde üretildiğini göstermektedir. Tez kapsamında, silindirik geometride, düzgün yapıda ve boncuk içermeyen nano boyutta fiberler 3B elektroeğirme tekniği ile başarılı bir şekilde üretilmiştir. Ayrıca, HA partiküllerinin fiberlerin yapısına katıldığı ve fiberler boyunca küçük kümeler şeklinde homojen olarak dağıldığı SEM görüntülerinden net bir biçimde izlenmektedir.

Şekil 4.5. Aynı elektroeğirme koşullarında üretilen PLGA/HA doku iskelelerine ait düşük ve yüksek büyümelerdeki SEM görüntüleri. (a) ve (b) 2B doku iskelesi, (c) ve (d) 3B doku iskelesi.

56 Şekil 4.6. (a) Üç boyutlu PLGA/HA doku iskelelerinin 3B üretim sonrası makroskobik görüntüsü, (b) 2B ve 3B PLGA/HA doku iskelelerinin makroskobik götüntüsü.

Fotoğraftaki soldaki görüntü 2B doku iskelesine ve sağdaki görüntü 3B doku iskelesine aittir.

Hidroksiapatit partiküllerin elektroeğirme ile üretilmiş PLGA/HA kompozit doku iskelelerinin yapısına katıldıklarını göstermek amacıyla XRD ve ATR-FTIR analizleri yapılmıştır. Şekil 4.7’de PLGA ve PLGA/HA kompozit doku iskelelerine ait XRD grafiği gösterilmektedir. İlgili literatür bilgisine göre, XRD grafiğinde görülen 10-25°

arasındaki geniş pik PLGA kopolimerinin amorf yapıda olduğunu göstermektedir [141].

Tez kapsamında kullanılan PLGA kopolimerine ait XRD grafiğinde 21.2°’de görülen geniş pik kopolimerin amorf yapısını desteklemektedir. Ayrıca, Şekil 4.7’de kırmızı halka içine alınmış 26° ve 32.1°’de görülen pikler HA pariküllerine ait karakteristik piklerdir ve HA partiküllerinin 3B PLGA doku iskelesi yapısına başarılı bir şekilde katıldığını kanıtlamaktadır.

57 Şekil 4.7. (a) PLGA doku iskelesine, (b) PLGA/HA kompozit doku iskelesine, (c) HA partüküllerine ait XRD grafikleri, (d) HA partiküllerinin Toz Kırınım Standartları Ortak Komitesi ’ne ait kırınım verileri.

Şekil 4.8’de PLGA doku iskelelerine ve PLGA/HA kompozit doku iskelelerine ait FTIR spektrumları verilmiştir. PLGA spektrumunda görülen 2949 cm^-1’deki pik –CH, 1746 cm-¹’deki C=O, 1452 cm^-1’deki –C-O gerilmesi, 1268 cm^-1’deki C-O-C eter gruplarına ve 1163 cm^-1’deki eter gruplarına ait karakteristik piklerdir ve bu pikler ilgili literatürle uyumludur [142]. Ek olarak, 555, 602 ve 1024 cm^-1’degörülen yeni pikler yapıda fosfat gruplarının varlığını göstermektedir. XRD ve ATR-FTIR sonuçları birlikte değerlendirildiğinde, HA’nın PLGA doku iskelelerinin yapısına başarılı bir şekilde katıldığı sonucuna ulaşılmıştır.

a)

b)

c)

d)

58 Şekil 4.8. PLGA doku iskelelerine, PLGA/HA kompozit doku iskelelerine ve HA’ya ait FTIR spektrumları.

Şekil 4.9. PLGA doku iskelelerine ve PLGA/HA kompozit doku iskelelerine ait termogramlar.

Üretilen PLGA doku iskelelerinin, HA partikülleri varlığında ve yokluğundaki termal özellikleri TGA analizi ile incelenmiş ve sonuçlar Şekil 4.9’da verilmiştir. Örneklere ait termogram incelendiğinde PLGA doku iskelelerinin 250°C’de bozunmaya başladığı görülmüştÜr. Ek olarak, PLGA doku iskelelerinin bozunma hızının maksimum olduğu sıcaklık 342°C olarak bulunmuş ve PLGA doku iskelelerinin yaklaşık 400°C’de kütlesinin tamamını kaybettiği görülmüştür. Yapıya HA partiküllerinin eklenmesi, PLGA’nın bozunma sıcaklığını 270°C’ye ve bozunma hızının maksimum olduğu

HA

PLGA/HA

PLGA

59 sıcaklığı ise 364°C’ye yükseltmiştir. Ayrıca, 400°C’den sonra PLGA kompozit doku iskelesinde değişme olmamıştır. Bu sıcaklığa kadar iskelenin toplam kütlesinin %79’u bozunmuştur. Elde edilen bu sonuçlar, polimer yapısına eklenen inorganik maddenin, polimere ait termal özellikleri geliştirdiğini göstermektedir [142].

Şekil 4.10. PLGA doku iskelelerine ve PLGA/HA doku iskelelerine ait gerilim-gerinim grafiği.

PLGA ve PLGA/HA doku iskelelerine ait gerilim-gerinim grafiği Şekil 4.10’da gösterilmiştir. Grafikte verilen sonuçlar incelendiğinde PLGA kopolimerinin yapısına HA’nın eklenmesiyle PLGA/HA kompozit doku iskelelerinin elastik modülünde yaklaşık 2 kat, kopma noktasındaki maksimum dayanımda ise 2.5 kat azalma görülmüştür. Ancak yüzde uzamada önemli bir fark görülmemiştir. Lee ve ark.

yaptıkları çalışmada PLGA yapısına belirli oranlarda (% 5, %10) HA partiküller ekleyince tüm mekanik özelliklerde bir artış görülürken, % 15 HA eklendiğinde, % 5 ve

%10 HA içeren gruplara kıyasla mekanik özelliklerde azalma olduğunu belirtmişlerdir.

Bu çalışmada da PLGA kopolimerine %24 oranında HA eklenmesi ile mekanik özelliklerde önemli ölçüde azalma görülmüştür. Literatürde HA ile polimer nanofiberleri arasındaki zayıf yapışmalar nedeniyle belli bir HA oranından sonra azalmanın görülebileceği belirtilmiştir [143].

Elde edilen tüm bulgular, düzgün geometride olmayan kemik hasarlarının tedavisinde, doğal kemik ECM yapısını mimik edebilecek benzer fiziksel ve kimyasal özelliklere

PLGA

PLGA/HA

60 sahip, kısa ve orta süreli iyileşme süresince kullanılabilecek 3B PLGA/HA kompozit doku iskelelerinin başarılı bir şekilde üretildiğini göstermektedir.

4.2. Üç Boyutlu PLGA/HA Doku İskelelerinde Yüzey Modifikasyon Çalışmaları