3. MATERYAL VE YÖNTEMLER
3.3. Balın Fizikokimyasal Analizleri
3.3.1. Balda Kül Miktarı ve Elektriksel İletkenlik Tayini
Balda % kül miktarı ve elektriksel iletkenlik tayini Uluslararası Bal Komisyonu [228]
tarafından belirlenen yöntemde değişiklikler yapılarak gerçekleştirilmiştir.
52
3.3.1.1.Örnek Hazırlanması
1. 1 g bal, porselen kroze içerisine tartılmıştır.
2. Tartılan bal, sıcaklığı 600 °C ‘ye ayarlanmış kül fırınına yerleştirilmiştir.
3. Kül fırınına yerleştirilen bal kül fırınında yaklaşık 6 saat yakılmıştır.
4. Kroze soğuduktan sonra tekrar tartılmıştır.
3.3.1.2. Kül Miktarı
Kül miktarı, yüzde ağırlık olarak ifade edilmiştir (g/100g).
3.3.1.3. Elektriksel İletkenlik
Elektriksel iletkenlik ise, yüzde kül miktarı ve elektriksel iletkenlik arasındaki ilişkiye göre saptanmıştır [229].
A: yüzde kül miktarı
C: Elektriksel iletkenlik (mS/cm) C= 0,14 + 1,74 A
3.3.2. Balda Refraktometre ile Nem Tayini
Baldaki nem miktarı, refraktometrik yöntem kullanılarak ölçülmüştür [170].
1. Bal kristalize olmuş ise nem miktarı tayininin doğruluğunu sağlamak için, örnek su banyosunda bekletilerek sıvı hale getirilmiştir.
2. 1 g bal alınarak, bal refraktometrenin cam haznesine konulmuştur.
3. Nemin yüzdesi, mercekli kısımdaki sayısal cetvelden okunmuştur.
3.3.3. Balda pH, Serbest Asitlik, Toplam Asitlik ve Lakton Asitliği Tayini
Balın, pH, serbest asitlik, lakton asitlik ve toplam asitlik değerleri Bogdanov’ un [228] geliştirdiği metot üzerinde değişikliler yapılarak uygulanmıştır.
3.3.3.1.Örnek Hazırlanması
1. Santrifüj tüpü içerisinde tartılan 5 g (M) balın, birkaç ml distile suda iyice çözülmesi sağlanmıştır. Bu karışım 50 ml’lik behere aktarılmış, karışım üzerine 50 ml’ye tamamlanana kadar distile su ilave edilmiştir.
2. Bu çözeltiden 25 ml alınarak, 250 ml’lik behere aktarılmıştır.
3. İlk pH’ı pH metre ile ölçülmüştür.
53
4. Çözelti manyetik karıştırıcı ile karıştırılarak 0,5’er ml ve 0,05 M’lık, 10 mL NaOH ile titre edilmiştir.
5. Bazik titrasyonu yapılan aynı beher içerisindeki bal örneği, ikinci eşlenik noktasına kadar 0,025 M’lık sülfirik asit H2SO4 ile geri titrasyon yapılmıştır.
3.3.3.2. pH
Balın bazik titrasyonuna başlamadan önce, ölçülen ilk pH değeri ile her bir örneğin pH’ı olarak tespit edilmiştir.
Şekil 3. 8. pH metre 3.3.3.3. Serbest Asitlik
Bal örneğinin 0,05 M’lık NaOH ile yapılan bazik titrasyonunda, pH’ın 7 yani nötr olduğu ilk dönüm noktasına kadar harcanan NaOH (V) miktarı kaydedilmiştir.
Serbest asitlik (S.A.), aşağıdaki eşitliğe göre hesaplanmıştır. Serbest asitlik= V* x T** x (50/25) x (1000/M***) meq/kg
* V: Harcanan NaOH miktarı
** NaOH’ın gerçek titrant değeri
***Örnek hazırlarken kullanılan balın ağırlığı
54
3.3.3.4. Lakton Asitliği
Asidik titrasyonu yapılan balın geri titrasyon sonucunda lakton asitliği aşağıdaki eşitliğe göre hesaplanmıştır [228].
L.A. = [(10-V) x T - 0.05 x V* ] x (50/25) x (1000/M) 3.3.3.5. Toplam Asitlik
Toplam asitlik ise aşağıdaki eşitliğe göre hesaplanmıştır [228].
Toplam asitlik (T.A.)= L.A.+ S.A.
3.3.4. Bal Örneklerinde Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi (HPLC) Cihazı ile Şeker Analizi
Baldaki şeker içeriğinin tespiti Uluslararası Bal Komisyonu’nun [228] belirlediği yönteme uygun olarak Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) kullanılarak aşağıda verilen şekilde yapılmıştır.
HPLC: Agilent Technologies 1200 Series, Dedektör: Refraktif Indeks (RID, G1362A), Kolon: 250 x 0,46 mm AGILENT karbohidrat kolonu, Mobil faz: Saf su + Acetonitrile (80/20, v/V), Kolon fırın sıcaklığı: 30ºC
Akış hızı: 1,3 ml / dakika, Enjeksiyon hacmi: 10 µl.
Şekil 3. 9. Yüksek Performanslı Likit Kromatografi (HPLC)
Bal örneklerinden 5,0 gram cam beherde tartılıp 40 ml damıtık suda çözdürülmüştür. Çözelti içine 25 ml metanol konularak çözelti damıtık su ile 100
55
ml’ ye tamamlanmıştır. Tüm örnekler 0,45 µm’lik filtrelerden süzülerek akış hızı 1,3 ml/min, kolon sıcaklığı 30°C, enjeksiyon hacmi 50 µl ve asetonitril /su oranı 80 ml/20 ml olan hareketli fazdaki HPLC cihazına enjekte edilmiştir.
Standart çözeltiler, 2 gr fruktoz, 1,5 gr glukoz ve 0,250 gr sukroz hassas terazi ile tartılarak bal örneklerine yapılan işlemin aynısı uygulanarak hazırlanmış olup, HPLC cihazına enjekte edilmiştir.
Numune çözeltiden elde edilen kromatogramdaki piklerin alıkonma zamanları standart çözelti ile elde edilen piklerin alıkonma zamanları ile karşılaştırılarak nitel tespit yapılmıştır.
Numune çözeltisi için elde edilen kromatogramdaki ilgili şeker türüne karşılık gelen piklerin pik alanları ve yükseklikleri ölçülerek nicel tayin yapılmıştır.
100 gram baldaki fruktoz, glukoz kütle yüzdesi şu şekilde hesaplanmıştır:
W = A1 x V1 x m1 x 100/ A2 x V2 x m0 Bu eşitlikte;
A 1 = Numunedeki şekerin pik alanı, A 2 = Standart şekerin pik alanı,
V1= Örnek solüsyonunu toplam hacmi (mL) V2= Standart solüsyonunun toplam hacmi (mL) m1=Standarttaki şeker miktarı (gr)
m0=Numune şeker miktarı (gr)
3.3.5. Bal Örneklerinde Hidroksimetilfurfural (HMF) Analizi
Balda HMF tayini Bogdanov [228] tarafından önerilen HPLC yöntemi ile gerçekleştirilmiştir.
HPLC: Agilent Technologies 1200 Series, Dedektör: UV Kolon: 250 x 0,46 mm AGILENT C 18 kolon
Mobil faz: Saf su + Methanol (HPLC Grade), Kolon fırın sıcaklığı: 30ºC, Akış. hızı:
1.5 ml / dakika, Enjeksiyon hacmi: 20 µl.
Saf su kullanılarak 1 ppm, 2ppm, 5 ppm ve 10 ppm değerlerinde HMF standart çözeltileri hazırlanmıştır. Elde edilen çözeltiler HPLC’ye enjekte edilmiştir.
56
Bal örneği ise, aşağıdaki şekilde hazırlanmıştır:
10 g bal 50 ml’lik beher içine tartılır. 25 ml suda çözülür ve 50 ml’lik balon jojenin içine transfer edilir. 50 ml’ye kadar su ile seyreltilmiştir.
Örnek solüsyonu kromatografiye hazırlamak için 0,45 mikron membran filtre ile süzülmüştür.
20 µl solüsyon viale konularak analiz edilmiştir.
Numunenin HMF içeriğini saptamak için, örneğin ilgili pik alanı ile standart solüsyonun pik alanı karşılaştırılarak sonuçlar hesaplanmıştır.
Şekil 3. 10. HMF için standart kalibrasyon eğrisi
Y= standart kalibrasyon eğrisinde bulunan değer (örn=179,7) x X
Y = Numunedeki HMF’nin pik alanı; X = Numunedeki HMF’nin ppm değeri
Her bal numunesinden 2’şer örnek hazırlanmış ve her örnek cihazda ikişer tekrarlı çalışılmıştır.
3.3.6. Balda Element Analizi
İz elementlerin konsantrasyonlarının tespitinde kullanılan kemometrik yöntem uygulamaları gıda maddelerini orjinlerine ve kalitelerine göre sınıflandırmada
57
kullanışlı bir yöntemdir. Ballarda element analizi Batista ve arkadaşları [188]
tarafından uygulanan metoda göre ICP-OES cihazı ile yapılmıştır.
Bal numunesi aşağıdaki şekilde hazırlanmıştır;
Numune hazırlanmadan önce ballarda kristalizasyonun olup olmadığı kontrol edilmiştir. Kristalizasyon görülmeyen ballar nazikçe karıştırılmıştır. Kristalleşme görülen, şeker kristallerinin bal ile homojenizasyonunun sağlanması için su banyosunda 65 °C’de 30 dakika ısıtılmıştır.
1000 mg bal tartılıp, 15 mL polipropilen falkon tüplerine konularak, üzerine 1000 mg distile su eklenmiştir. Bu çözeltiden 400 µL alınıp 20 dakika 200 µL 14 mol/L nitrik asitte( HNO3)’de inkübe edilmiştir. Son hacim distile su ile 10 mL’ye ayarlanmıştır. Nitrik asidin final konsantrasyonu %2 v/v’dir. Analitik kalibrasyon standartları günlük olarak 1-20 µg/L konsantrasyonlarında hazırlanmıştır.
Numuneler ve standartlar ICP-OES cihazı ile okutulmuştur.
3.3.7. Balda Toplam Fenolik Asitlik Analizi
Balların toplam fenolik asitlik miktarı spektrofotometrik Folin-Ciocalteu metodu ile gerçekleştirilmiştir [230].
1. 1 gr bal örneği, 20 mL distile su ile dilüe edilmiştir.
2. 1 mL bal solüsyonu 5 mL 0,2 N’lik Folin-Ciocalteu çözeltisi ile karıştırılarak, 5 dakika inkübasyona bırakılmıştır.
3. Daha sonra bu çözeltinin üzerine 4 mL %75 w/v sodyum karbonat (Na2CO3) solüsyonu eklenmiş ve oda sıcaklığında 2 saat inkübasyona bırakılmıştır.
4. Reaksiyon karışımının absorbansı, blank olarak kullanılan distile suya karşı 765 nm’de ölçülmüştür.
5. 5 µg/mL ile 100 µg/mL konsantrasyonlarında gallik asit kullanılarak standart kalibrasyon eğrisi oluşturulmuştur (Şekil 3.11).
58
Şekil 3. 11. Gallik Asit analizi için kalibrasyon eğrisi
Toplam fenol konsantrasyonu, 1 kg balda mg gallik asit eşitliği (GAE) cinsinden verilmiştir.
Sonuçlar aşağıdaki eşitliğe göre hesaplanmıştır;
GAE(mg/L) x toplam hacim (mL)x 10-3 L/mL]
Toplam Fenol İçeriği (mg GAE/kg bal) =
İlk örnek (g)x 10-3 kg/g
3.3.8. Bal Örneklerinin Renk Yoğunluğunun Belirlenmesi
1. Balda renk yoğunluğu Pontis ve arkadaşları [230] tarafından belirlenen metoda göre gerçekleştirilmiştir.
%50 (w/v) bal solüsyonu 45-50 ºC’de sıcak su ile hazırlanmış ve filtre edilmiştir.
2. Örnekler, UV-VIS spektrofotometrede okutulmuştur.
3. Net absorbans 450 nm ve 720 nm arasındaki fark hesaplanarak elde edilmiştir.
4. Sonuçlar mAU cinsinden verilmiştir.
59
Şekil 3. 12. Renk analizi için hazırlanan bal örnekleri
3.3.9.Balda LC-MS/MS Cihazı ile Antibiyotik Kalıntı Analizi
Bu çalışmada, ballardaki antibiyotik kalıntısı JASEM firmasının ballarda kalıntı tayini analizi reaktifleri kullanılarak LC-MS/MS (Likit Kromatografi Kütle/ Kütle Spektrometrisi cihazında analiz edilmiştir.
1 gr bal örneğine, 10 mL distile su, 50 µL 1 mg/L internal standart solüsyonu eklenmiştir ve örnekler 2 dakika su banyosunda bekletilmiştir. 20 mL methanol eklenmiş ve cihazda örnekler okutulmuştur [231].
3.3.10. Balda Etanol Metanol Ekstraksiyon Yöntemi Kullanılarak Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (GC-MS) ile Uçucu Bileşen Tayini
Bu analiz için Salonen ve arkadaşlarının [232] gerçekleştirdiği metot üzerinde değişiklikler yapılmıştır. Cam bir santrifüj tüpüne 10 g bal örneği tartılmıştır.
Örneğin üzerine 10 ml metanol ilave edilmiştir. Bu karışım tüpün ağzı açık bırakılarak kurutulmuştur. Karışım kuruduktan sonra üzerine 10 ml etanol ilave
60
edilmiş, bu ekstraksiyon ağzı kapalı olarak 24 saat bekletilmiş, 24 saat sonunda etanolün uçması sağlanmıştır. Etanol tamamen uçtuktan sonra santrifüj tüpünün dibindeki kalıntıya, 0,5 ml etanol eklenmiştir. Maddelerin ekstraksiyonunu sağlamak için çözeltinin, vorteks ile iyice karıştırılması sağlanmış ve ekstrakte olan kısımdan 0,1 μl çekilerek, GC-MS cihazına enjekte edilmiştir. Bu amaçla kullanılan GC-MS koşulları aşağıda verilmiştir;
Model: Agilent N 6890 GC ye bağlı Agilent 5973 model MS sistemi Taşıyıcı gaz: Helyum
Kolon tipi: DB5 kılcal kolon ve ölçüleri 0.25 mm * 30m * 0.25 μm’dir.
Bu yöntem ile analizi yapılan ballar, karanlık ve nemden uzak bir dolapta saklanmış, uçucu bileşenlerin stabilitesinin bu şartlar altında değerlendirilmesi için altı ay sonra tekrar aynı yöntem ile çalışılmış ve içerik açısından değerlendirilmiştir.
3.3.11. Balda Katı Faz Mikroekstraksiyon (SPME) Yöntemi Kullanılarak Gaz Kromatografi-Kütle Spektrometresi ile Uçucu Madde Tayini
Uçucu bileşen analizi Wolski ve arkadaşları’nın [233] yapmış olduğu yöntemde modifikasyonlar yapılarak gerçekleştirilmiştir. Her bal örneği için 10 gr bal 0,5 gr anhidröz sodyum sülfat ve 25 μl internal standart (1-nonanol solüsyonu) içeren viale eklenmiştir. Vial içeriği 70°C’de 30 dakika manyetik karıştırıcılı ısıtıcı üzerinde bekletilmiştir. Manuel SPME (katı faz mikro ekstraksiyon) aygıtının iğnesi vialin septumu delinerek vial içerisine yerleştirilmiş ve 50μm film kalınlığında Divinilbenzen/Karboksen/Polidimetilsiloksan (DVB/CAR/PDMS) faz ile kaplanmış fiber vial içerisindeki tepe boşluğu kısmına indirilmiştir. Bileşenlerin fiber üzerindeki faza adsorbe olmaları amacıyla 20 dk bu konumda tutulmuştur. Fiber tekrar iğneye çekilip, vialden çıkarılmıştır. Hemen GC-MS’e enjeksiyon yapılmıştır. Bu amaçla kullanılan GC-MS koşulları aşağıda verilmiştir;
Model: Agilent N6890 GC System Agilent 5973 MS
Enjeksiyon sıcaklığı: 250 °C Taşıyıcı gaz: Helyum
61
Taşıyıcı gaz akış hızı: 1,2 ml/dak
Fırın sıcaklık programı: Başlangıç sıcaklığı 40 °C olup, bu sıcaklıkta 1 dakika bekletilmiştir. Sıcaklık 10 °C/dk artırılarak, 300 °C’ye getirilmiştir. 280°C’de 3 dakika tutulup, 20°C/dak artışla 230 °C’ye getirilmiş bu sıcaklıkta 1 dak bekletilmiştir.
Dedektör sıcaklığı: 280 °C
Kolon tipi: Db5 kılcal kolon ve ölçüleri 0.25mm * 30m * 0.25μm’dir