• Sonuç bulunamadı

Üç Boyutlu PLGA/HA Doku İskelelerinde Yüzey Modifikasyon Çalışmaları

4. DENEYSEL SONUÇLAR ve TARTIŞMA

4.2. Üç Boyutlu PLGA/HA Doku İskelelerinde Yüzey Modifikasyon Çalışmaları

60 sahip, kısa ve orta süreli iyileşme süresince kullanılabilecek 3B PLGA/HA kompozit doku iskelelerinin başarılı bir şekilde üretildiğini göstermektedir.

4.2. Üç Boyutlu PLGA/HA Doku İskelelerinde Yüzey Modifikasyon Çalışmaları

61 iskelelerine olan etkisi ise su temas açıları ve SEM görüntüleri ile değerlendirilmiştir.

Şekil 4.11’de 0.1M ve 0.2M çözeltilerinde 5 dk süresince bekletilen iki boyutlu PLGA doku iskelelerine ait su temas açıları gösterilmektedir. Şekil 4.11’de muamele edilmemiş kontrol grubu örneği olan PLGA doku iskelelerinin su temas açısı yaklaşık 127.1° iken, Şekil 4.11.b ve c’de 0.1M ve 0.2M NaOH ile 5 dk süre ile muamele edilmiş örneklerin su temas açıları sırasıyla 99° ve 32° olarak ölçülmüştür. Uygulanan alkali işleminde çözelti derişimi arttıkça su temas açılarındaki azalma, PLGA nanofiber yüzeylerde hidroksil ve karboksil grubunun artması sonucu PLGA doku iskelelerinin daha hadrofilik yapıya dönüştüğü göstermektedir ve bu sonuçlar ilgili literatürle uyumludur [145].

Şekil 4.11. 2B PLGA doku iskelelerine ait su temas açısı görüntüleri. (a) kontrol grubu, (b) 0.1M NaOH ve (c) 0.2M NaOH ile muamele edilmiş örnekler.

Su temas açı ölçümleri sonucunda, uygun hidroliz derişimin belirlenmesi için 3B PLGA doku iskeleleri 5 dk süresince 0.1 ve 0.2 M NaOH içersinde bekletilmiş ve örneklerin morfojileri SEM analizi ile incelenmiştir. Şekil 4.12. e ve f’de, kontrol grubuna kıyasla 0.2 M NaOH ile 5 dk süresince muamele edilen 3B PLGA nanofiberlerinin kırıldığı, yüzey özellikleri dışında yığın bozunmanın etkisiyle yapısal bütünlüğün de değiştiği görülmektedir. Ancak Şekil 4.12.b ve c’de 0.1 M NaOH ile 5 dk süresince muamele edilen 3B PLGA nofiberlerinin Şekil 4.12.a ve b’deki kontol grubuna oldukça benzediği, fiberlerin muamele sonrası hala pürüzsüz, silindirik şekilde ve iskelenin gözenekli yapıda olduğu görülmektedir. Elde edilen bulgular incelendiğinde en uygun NaOH derişimi 0.1M olarak seçilmiştir.

62 Şekil 4.12. 3B Boyutlu PLGA doku iskelelerinin düşük ve yüksek büyütmelerdeki SEM görüntüleri. (a) ve (b) kontrol grubu, (c) ve (d) 0.1 M NaOH ile 5 dk süre ile muamele edilmiş, (e) ve (f) 0.2 M NaOH ile 5 dk süre ile muamele edilmiş örmekler.

İki boyutlu PLGA doku iskeleleri hidroliz süresinin belirlenmesi için 0.1 M NaOH çözeltisi içerisinde 5 dk, 10 dk, 15 dk ve 30 dk süresince bekletilmiş ve örneklerin 10 dk’dan sonra bozunduğu görülmüştür. Şekil 4.13 b,c ve d’de yapısal özellikleri bozulmuş 2B PLGA doku iskeleleri görülmektedir. Sonuçta, 0.1 M NaOH çözeltisinde muamele süresi 5 olarak uygulanmıştır.

63 Şekil 4.13. 0.1 M NaOH çözeltisinde (a) 5 dk, (b) 10 dk, (c) 15 dk ve (d) 30 dk süreyle bekletilmiş PLGA doku iskelelerine ait görüntüler. Doku iskeleleri beyaz renkte olan yapılardır.

Yüzey modifikasyonu yönteminin polimerin yığın özelliklerini değiştirmeden, fiber üzerinde optimum düzeyde fonksiyonel grupları oluşturması gerekir [44]. Şekil 4.13.b, c ve d’de doku iskelerinde uygulanan işlemin sadece yüzey özelliklerini değil yığın özellikleri de değiştirdiği ve iskelelerin parçalanmasına ve bozunmasına yol açtığı görülmektedir.

Derişimi 0.1M NaOH ile farklı sürelerde uygulanan alkali işleminin 2B PLGA doku iskelelerinin ıslatılabilirliğine olan etkisi su temas açısı ölçümleri ile değerlendirilmiştir.

Şekil 4.14.’de 0.1M NaOH çözeltisinde 5 ve 10 dk süresince bekletilen iki boyutlu PLGA doku iskelelerine ait su temas açıları gösterilmektedir. Şekil 4.14.a’da muamele edilmemiş kontrol grubu örneği olan PLGA doku iskelesinde su temas açısı yaklaşık 127.1° iken, Şekil 4.14.b ve c’de 0.1M NaOH ile 5 ve 10 dk süre ile muamele edilmiş örneklerin su temas açıları sırasıyla 99° ve 96° olarak ölçülmüştür. Uygulanan alkali işleminin süresi artıkça su temas açılarındaki azalma, PLGA nanofiber yüzeylerde hidroksil ve karboksil grubunun artması sonucu PLGA’nıın daha hidrofilik yapıya dönüştüğü göstermektedir ve bu sonuçlar ilgili literatürle uyumludur [145]. Ayrıca, Şekil 4.14.c’de yapının kısmen bozunmasından dolayı su temas ölçümleri her bir paralel için (n=3) tam olarak ölçülememiştir. Bu nedenle, Şekil 4.14.a ve b kıyaslandığında doku iskelelelerin bütütünsel yapısının korunması açısından, en uygun hidroliz süresi 5 dk olarak belirlenmiştir.

64 Şekil 4.14. PLGA doku iskelelerine ait 2B su temas açısı görüntüleri. (a) kontrol grubu, b) 0.1M NaOH ile 5 dk muamele edilmiş, c) 0.1M NaOH ile 10 dk muamele edilmiş örnekler.

Elde edilen su temas açısı ve SEM analizleri sonucunda, PLGA doku iskelelerinde hidrofiliste özelliklerinin geliştirilmesi için optimum hidroliz derişimi ve süresi sırasıyla 0.1M 5 dk ve 5 dk olarak seçilmiştir. Bu parametreler daha sonra, Bölüm 4.1.5’te detaylandırılan hücre kültür çalışmaları için 3B PLGA/HA kompozit doku iskelelerine uygulanmıştır.

Belirlenen koşullardaki yüzey modifikasyonu, hücre kültür çalışmaları için aynı eğirme parametreleri ile üretilmiş 3B PLGA/HA doku iskelelerine uygulanmış ve iskeleler oda sıcaklığında kurutulmaya bırakılmıştır. Ardından % 70’lik etanol ile sterilizasyonu gerçekleştirilen doku iskelelerinin oda sıcaklığında steril koşullar altında kurutulduğunda hacminin yaklaşık % 50’sini kaybettiği, hücre kültür ortamı içerisinde 37℃’ de yaklaşık 2 saat kaldıktan sonra ise toplam hacim kaybının % 80’lere çıktığı görülmüştür. Literatürde PLGA kopolimerinin 37℃ ve yukarısındaki sulu ortamda hacminin % 80 oranında azaldığı ve bu duruma bağlı olarak PLGA doku iskelelerinde boyut ve gözeneklerin önemli ölçüde değiştiği bildirilmiştir. Ek olarak boyut ve gözeneklerdeki bu küçülme sonucunda hücrelerin iskeleye tutunmadığı ve iskele içine penetre olmadığı sonucuna varılmıştır [146]. Tez kapsamında yapılan ve Bölüm 4.4.’te detaylandırılan hücre kültür çalışmaları da bu sonucu desteklemiştir.

İlgili literatür incelendiğinde Jin ve ark. elektroğieme ile üretilen poli-DL-laktit asitteki büzüşme problemini önlemek için, PDLLA polimerini farklı oranlardaki polietilenglikol (PEG) karıştırarak eğirmiştir. Ancak, iskelelerin büzüşme sorunu, farklı PEG karıştırma oranları ayarlanarak kısmen aşılmış olsa da, bu yaklaşım her biyomalzeme için geniş ölçüde uygulanamamaktadır [146]. Zhou ve ark. düzgün morfoloji ve boyutta

65 nanofibroz PLGA iskelelerini elde etmek ve nanofiberlerin küçülmesini önlemek için toplayıcı olarak bakır bir ızgara tel kullanıldığını bildirmiştir. Ancak geleneksel PLGA görülen yaklaşık % 80 boyutsal küçülmeyle karşılaştırıldığında, büzüşme probleminin hala devam ettiği (%53) görülmüştür [146, 147].

Elektroeğirme işleminin amorf polimer zincirlerini gerdiği bilinmektedir. Elektroeğirme ile üretilmiş doku iskeleleri eğer, üretildiği polimere özgü camsı geçiş sıcaklığına yakın veya daha yüksek bir sıcaklığa ısıtılırsa, gerilmiş haldeki amorf zincirler gevşer ve ikincil gevşemeler sonucunda polimer tabanlı iskelelerde boyutsal değişikliklere neden olan moleküler seviye gerginliğini (molecular level strain) serbest bırakır. Camsı geçiş sıcaklığı 37℃’nin üzerinde olan PLGA kopolimerindeki küçülmenin önlenmesi için Henderson ve ark. tarafından geliştirilen reçete kullanılmıştır [148]. Bir yüzey aktif maddesi olan Pluronik® F127 kullanılarak geçekleştirilen yüzey modifikasyonunun 3B PLGA/HA kompozit doku iskeleleri üzerindeki etkisi SEM analizleri ile incelenmiştir.

Şekil 4.15. c ve d incelendiğinde, kontrol grubuna kıyasla muamele sonrası 3B PLGA/HA kompozit doku iskelelerine ait nanofiberlerin gerilmiş haldeki amorf polimer zincirlerinin gevşemesi sonucu yapının sıkıştırılabilir olma özelliğini kaybettiği ve üst üste sıkı bir şekilde istiflenerek, fiberler arasındaki boşluklar ve gözenekler önemli oranda azaldığı görülmektedir. Şekil 4.16.’da 37℃’ de bekletilen 3B PLGA/HA doku iskelelerinin makroskobik görüntülerinden de anlaşılacağı üzere iskelelerin başlangıç hacminin yaklaşık % 80’ini kaybettiği görülmektedir ve sonuçlar literatürle uyumludur [146]. Ancak Şekil 4.16.e ve f’de Pluronik® F127 işlem uygulaması sonucunda, oda sıcaklığında jel haline gelen Pluronik® çözeltisinin 3B PLGA/HA doku iskelesi içine nüfuz etmesi nanofiberlerin merkeze doğru hareket etmesini engellemektedir. Bu sayede Pluronik®, elektroeğirme sonucu gerginleşen amorf polimerlerin moleküler seviye gerginliğini koruyarak, polimer boyutunu ve gözenekliliği sabitlemektedir. Ek olarak görüntülerde Pluronik® uygulanan grupta, bazı nanofiberler için kırılmalar olmasına rağmen yapısal bütünlüğün korunduğu görülmektedir. Şekil 4.16.a’da +4°C’de sıvı haldeki Pluronik® çözeltisinin kolayca 3B doku iskelelerinin içine nüfuz ettiği görülmektedir. Şekil 4.16.c’de verilen görüntülerde Pluronik® işlem uygulaması sonrası iskelelerin hala 3B yapısını koruduğu, sıkıştırılabilir ve oldukça yumuşak bir formda olduğu görülürken, Şekil 4.16.b’de 37°C’de 2 saat bekletilmiş 3B PLAGA/HA doku iskelesinde boyut olarak % 50 azalma tespit edilmiştir. Şekil 4.15 ve 4.16’da

66 verilen sonuçlar ışığında Pluronik® ile muamele 3B PLGA/HA doku iskelelerinde oda sıcaklığında veya 37℃’de görülen hacim ve boyuta bağlı gerçekleşen küçülme sorununu ortadan kaldırdığı görülmüştür ve tez çalışması kapsamında gerçekleştirilen hücre kültür çalışmalarında Pluronik® ile muamele sonrasındaki doku iskeleleri kullanılacaktır [146].

67 Şekil 4.15. Üç Boyutlu PLGA/HA doku iskelerine ait (a) ve (b) kontrol grubu, (c) ve (d) maumele ve sterilizasyon sonrası, (e) ve (f) Pluronik® F127 ile muamele sonrası düşük ve yüksek büyütmelerdeki SEM görüntüleri.

68 Şekil 4.16. 3B PLGA/HA doku iskelerine ait makroskobik görüntüler. (a) İki saat süre ile 37˚C sıcaklıkta bekletilmeden önce ve bekletildikten sonra doku iskelelerine aittir.

(b) Pluronik® F127 ile muamele öncesi ve sonrasındaki doku iskelelerine aittir.

Şekil 4.17.’te 3B PLGA/HA doku iskelelerinin ıslatılabilirlik özellikleri su tutma kapasitelerine göre değerlendirilmiştir. Yirmi beş mL PBS (pH:7.4) içerisinde bekletilen doku iskelelerinde her iki grup için ilk 2 saatte su tutma kapasitelerinde çok hızlı bir artış olmuş ve iskeleler bir hafta sonra denge şişme değerine ulaşmıştır. Kompozit doku iskelelerinin muamele öncesi su tutma kapasitesi yaklaşık % 313 iken, muamele sonrasında yüzeyinde karboksil ve hidroksil uç gruplarının artması sonucu bu oran % 390’a yükselmiştir. Bu veriler, alkali muamelesinin, iskelelerin hidrofilisitesini geliştirdiğini doğrulamaktadır ve sonuçlar literatürle uyumludur [149].

a)

d) c)

b)

69 Şekil 4.17. PLGA/HA kompozit doku iskelelerinin zamanla su tutma kapasitelerindeki değişim (PLGA/HA-M: HA ve NaOH ile muamele edilmiş PLGA/HA doku iskelesi).

Şekil 4.18’de verilen PLGA/HA kompozit doku iskelelerine ait FTIR spektrumlarında 3 fonksiyonel gruba ait absorbsiyon bantları görülmektedir. Bunlar, C=O, C-H ve C-O fonksiyonel gruplarıdır. Şekil 4.18’de muamele edilmemiş PLGA/HA doku iskelesinde 1749 cm-1 ‘de ester karbonil gerilmesi; 1452, 1423 ve 1383 cm-1’de C-H gerilmeleri;

1086, 1130, 1167 ve 1270 cm-1’de C-O gerilmelerine ait karakteristik bantlar yer almaktadır. NaOH ile muamele edilen PLGA fiberlerinde de PLGA’ya bağlı karakteristik grupların varlığı yapının yığın özelliklerini değiştirmeden yüzey modifikasyonunun başarılı bir şekilde uygulandığını göstermektedir. Alkali yüzey modifikasyonunda ester gruplarının (R1COOR2), karboksilik asit (R1COOH) ve alkanol (R2OH) gruplarına hidrolizi gerçekleşmektedir. Muamele sonrasında PLGA/HA doku iskelesinde C=O bandının şiddetindeki azalma yapıdaki ester gruplarının karboksilik asit ve ester gruplarına hidrolizi sonucu meydana gelmektedir ve yapının hidrofilisite özelliğinin arttığını göstermektedir. Sonuçlar ilgili literatürle uyumludur [145].

70 Şekil 4.18. PLGA/HA ve NaOH ile muamele edilmiş PLGA/HA (PLGA/HA-M) kompozit doku iskelelerine ait FTIR spektrumları.

C=OC=O

71

Benzer Belgeler